橋本氏甲狀腺炎患者外周血免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞比例異常①

何 珂 陸西宛 朱麗華 卞榮蓉 姜 燕

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院(南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院)內(nèi)分泌科，無錫214000)

橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)，又稱慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是一種以自身甲狀腺組織為抗原，甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody，TGAb) 為抗體的慢性自身免疫性疾病[1-3]。HT病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制與遺傳、免疫及環(huán)境等因素相關(guān)，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤，自身抗原特異性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生、特異性甲狀腺自身抗體的升高，以及甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)的破壞[4,5]。HT是甲狀腺特異性自身免疫性疾病，抑制性T細(xì)胞在一定條件下，可異常允許輔助性T細(xì)胞與抗原相互作用，并直接作用于甲狀腺細(xì)胞，造成甲狀腺細(xì)胞損傷，但具體免疫學(xué)機(jī)制尚未完全清楚。免疫學(xué)角度研究下，橋本氏甲狀腺炎是細(xì)胞免疫和體液免疫相互作用的結(jié)果，外在表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞亞群的失衡和細(xì)胞因子變異[6]，抑制性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群調(diào)控并作用于人體的免疫耐受機(jī)制，在HT等自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生及病程進(jìn)展中起一定作用。本研究通過采用流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群比例，觀察HT患者與健康對照外周血免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞比例間的差異，探討免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群在HT發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選自2017年7月至2018年7月于無錫市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的HT患者88例，患者均為甲功正?；騺喤R床甲減患者，其中男11例，女77例,年齡22～70歲，平均年齡(42.23±12.47)歲。HT診斷依據(jù)橋本氏甲狀腺炎森田陸診斷標(biāo)準(zhǔn)：①彌漫而堅(jiān)韌的甲狀腺腫大；②血清TPOAb和/或TGAb陽性；③甲狀腺機(jī)能正常/亢進(jìn)/減退；④超聲特點(diǎn)：橋本甲亢及甲功正常的甲狀腺實(shí)質(zhì)回聲以彌漫性減低、局限性片狀減低，橋本甲減的實(shí)質(zhì)回聲以彌漫性減低伴纖維條索樣強(qiáng)回聲，多呈網(wǎng)格狀。CDFI：橋本甲亢患者呈現(xiàn)豐富彩色血流，橋本甲減和甲功正?；颊哐髀猿试龆啾憩F(xiàn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重心、腦、肝、腎疾病患者；②伴有腫瘤、風(fēng)濕或血液系統(tǒng)疾病患者；③合并Graves病，甲亢危象、黏液性水腫昏迷者；④妊娠或哺乳期婦女。

正常對照組：在本院健康體檢的人群中，隨機(jī)選取102例性別年齡匹配的健康者作為對照，男13例，女89例，年齡25～69歲，平均年齡(44.70±13.06)歲。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核(倫理審查編號2018011716)，研究前所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1患者甲狀腺功能、抗體及甲狀腺體積檢測 分別留取HT患者及正常對照者外周靜脈血，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清TSH (參考范圍0.27～4.20 mU/L)、FT3 (參考范圍：3.1～6.8 pmol/L)、FT4 (參考范圍：12.0～22.0 pmol/L)、TGAb (參考范圍：0～115 U/ml)、TPOAb (參考范圍：0～34 U/ml)、TRAb (參考范圍：0～1.75 U/L)。甲狀腺雙葉左右、前后及上下徑采用彩色多普勒超聲測量，甲狀腺體積(cm3)=左右徑(cm)×前后徑(cm)×上下徑(cm)×0.479。

1.2.2淋巴細(xì)胞亞群檢測 流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目及其比例：①CD3+總T淋巴細(xì)胞；②CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞；③CD3+CD8+抑制性T細(xì)胞；④CD4+/CD8+輔助性T細(xì)胞/抑制性T細(xì)胞比值；⑤CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞；⑥CD3-CD(16+56)+NKT細(xì)胞。

取EDTA抗凝全血標(biāo)本2 ml，A、B管中各加入50 μl全血；A管中加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC熒光標(biāo)記抗體10 μl，B管中加入CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC熒光標(biāo)記抗體10 μl(熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體均為 Beckman Coulter公司產(chǎn)品)；混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入FACSysing(1×)450 μl/管，充分混勻，室溫避光反應(yīng)10 min；每管加入PBS 1 ml，1 500 r/min離心5 min，小心棄上清；加入PBS 500 μl，混勻，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群。

2 結(jié)果

2.1HT組與對照組甲狀腺功能、抗體及甲狀腺體積比較 與正常對照組相比，HT患者TSH水平升高(P<0.01)，F(xiàn)T4水平顯著下降(P<0.01)，而FT3水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甲狀腺相關(guān)抗體TPOAb(P<0.01)、TGAb(P<0.01)顯著升高，而TRAb未見明顯變化；甲狀腺體積盡管HT組略大于正常對照，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2HT組與對照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 與對照組相比，HT患者抑制性T細(xì)胞比例降低(24.74±6.42 vs.26.97±5.25，P<0.05)，輔助性T細(xì)胞比例升高(42.37±8.39 vs.39.15±9.91，P<0.05)， 輔助性T 細(xì)胞/抑制性T細(xì)胞比例升高(1.90±0.81 vs.1.54±0.59，P<0.01)，總T細(xì)胞比例差異未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(69.20±7.98 vs.68.43±9.39，P>0.05)，見圖1、表2。

ItemsControl groupHT groupTSH (mU/L)2.33±1.474.29±3.091)FT3 (pmol/L)4.51±0.814.50±0.72FT4 (pmol/L)16.83±2.5915.31±3.281)TRAb (U/L)0.38±0.040.55±0.14TPOAb (U/ml)20.04±13.52217.66±183.601)TGAb (U/ml)15.77±1.53622.23±113.071)Thyroid volumes (ml)12.12±7.0912.77±5.12

Note:1)P<0.01 vs.control group.

ItemsControl groupHT groupT68.43±9.3969.20±7.98Ts26.97±5.2524.74±6.421)Th39.15±9.9142.37±8.391)Th/Ts1.54±0.591.90±0.812)B12.00±4.3014.32±5.342)NKT12.98±7.0016.84±8.302)

Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs.control group.

圖1 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HT組與對照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例Fig.1 Proportions of T lymphocyte subsets in peripheral blood of HT group and control group detected by flow cytometry

圖2 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HT組與對照組外周血B淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞比例Fig.2 Proportions of B lymphocytes and NKT cells in peripheral blood of HT group and control group detected by flow cytometry

2.3HT組與對照組外周血B淋巴細(xì)胞水平比較 與對照組相比，HT患者B淋巴細(xì)胞比例顯著升高(14.32±5.34 vs.12.00±4.30，P<0.01)，見圖2、表2。

2.4HT組與對照組外周血NKT細(xì)胞水平比較 與正常對照組相比，HT患者NK細(xì)胞比例顯著升高(16.84±8.30 vs.12.98±7.00，P<0.01)，見圖2、表2。

3 討論

橋本氏甲狀腺炎是甲狀腺特異性自身免疫性疾病，發(fā)病率在0.3%～10%，40～60歲約占56%，男女比例約1∶7[8,9]。TPO被認(rèn)為是HT的致病因素之一，TPOAb通過激活補(bǔ)體、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和致敏的NKT細(xì)胞直接殺傷等機(jī)制，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，使甲狀腺激素合成減少，導(dǎo)致甲狀腺機(jī)能減退。TPOAb陽性是發(fā)生甲狀腺機(jī)能減退的危險(xiǎn)因素，TPOAb滴度反映淋巴細(xì)胞的浸潤程度。TGAb則是TG的自身抗體，其結(jié)合使TG水解增加，從而影響甲狀腺素的合成，TGAb在AITD中陽性率較高，作為診斷AITD的另一指標(biāo)[10]。因而，在臨床上檢測血清TPOAb、TGAb的滴度，可作為HT診斷、治療和預(yù)后的重要依據(jù)。本研究中，入組的HT患者TSH升高，F(xiàn)T4下降，F(xiàn)T3無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，甲狀腺相關(guān)抗體TPOAb、TGAb顯著升高，TRAb未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)合甲狀腺彩超，嚴(yán)格符合HT診斷標(biāo)準(zhǔn)。

HT是T細(xì)胞介導(dǎo)的甲狀腺特異性自身免疫性疾病。在本研究中，與健康對照組相比，HT患者外周血抑制性T細(xì)胞數(shù)目降低，而輔助性T細(xì)胞數(shù)目增多，輔助性T細(xì)胞/抑制性T細(xì)胞比例升高，提示HT患者體內(nèi)存在抑制性T細(xì)胞的缺陷及輔助性T細(xì)胞比例的失衡。與研究報(bào)道一致，在HT外周血中，由于輔助性T細(xì)胞功能相對活躍，而抑制性T細(xì)胞存在數(shù)目的減少、甚至功能的缺陷，輔助性T細(xì)胞與抑制性T細(xì)胞之間的平衡被破壞，從而表現(xiàn)為甲狀腺免疫功能的紊亂[11]。抑制性T細(xì)胞，又稱為Treg細(xì)胞，能通過細(xì)胞間直接接觸或間接分泌TGF-β、 IL-10等細(xì)胞因子，在輔助性T細(xì)胞亞群主要包括Th1、Th2的分化及Th1/Th2平衡中起重要作用[12,13]。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體研究中均已表明，抑制性T細(xì)胞數(shù)目的減少或/和功能的降低與 HT 和毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves′s disease，GD)的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。去除Treg可明顯提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物GD的發(fā)生率，而進(jìn)一步去除Treg可使其向HT轉(zhuǎn)化[14]，進(jìn)一步證實(shí)Treg異常及免疫耐受缺陷在HT發(fā)病中的作用。

HT是細(xì)胞免疫和體液免疫共同作用的結(jié)果，特定因素作用下，機(jī)體產(chǎn)生的特異性CD4+T淋巴細(xì)胞主要針對甲狀腺自身抗原，其活化自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞至甲狀腺進(jìn)而產(chǎn)生自身抗體。B淋巴細(xì)胞浸潤甲狀腺組織，產(chǎn)生大量的TGAb、TPOAb等抗體，使甲狀腺發(fā)生細(xì)胞浸潤性炎癥，大量淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞破壞、損傷，最終表現(xiàn)為甲減[6,15]。本研究中，HT患者外周血B細(xì)胞比例與健康對照相比顯著升高，提示B淋巴細(xì)胞在HT發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

NKT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞亞群之一，表面既可以恒定表達(dá)T細(xì)胞受體，也可以表達(dá)NK細(xì)胞的表面分子，因而同時(shí)具備NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的一些特性。IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子則由活化后的NKT細(xì)胞快速、大量分泌，因NKT細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IFN-γ及IL-4，NKT細(xì)胞的異常也伴隨自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。此外，IFN-γ還可以通過抑制TPO、TG、促甲狀腺激素受體及鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體等的表達(dá)，抑制甲狀腺激素的合成。本研究中，HT患者外周血NKT細(xì)胞比例與健康對照組相比顯著上升，提示NKT細(xì)胞參與HT的發(fā)病機(jī)制。

綜上，HT患者外周血中存在免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的失衡及免疫功能的紊亂，抑制性T細(xì)胞比例下降，而輔助性T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NKT細(xì)胞比例上升。抑制性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NKT細(xì)胞等作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，均在HT的發(fā)生及病程發(fā)展中起重要作用，但其具體發(fā)病機(jī)制及免疫學(xué)作用還有待進(jìn)一步探索，為HT等自身免疫性甲狀腺疾病的免疫學(xué)診斷及治療提供新思路。