免疫抑制劑FK506對結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響及作用機制研究①

姜海波 李 衛(wèi) 姜 霞 裴永彬

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外三科，石家莊050031)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，可向肝臟、肺、腹膜等臟器轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的重要因素，近年來結(jié)直腸癌化療和分子靶向治療取得了巨大進步，但臨床上對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的治療并沒有實質(zhì)性突破[1，2]，因此研究新的抑制結(jié)直腸癌生長及侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物對改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要意義[3]。FK506為新型免疫抑制劑，在肝移植、腎移植中的應(yīng)用日益成熟[4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)FK506對膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤細胞具有抑制作用[5，6]，但FK506對結(jié)直腸癌細胞的影響尚不清楚。本文中FK506對結(jié)直腸癌細胞HCT116的增殖、侵襲、遷移的影響及可能機制進行研究，為結(jié)直腸癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 細胞株：結(jié)直腸癌細胞株HCT116和SW480購自中國科學(xué)院細胞庫。主要試劑：免疫抑制劑FK506、辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG抗體、鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體、鼠抗人MMP2單克隆抗體、鼠抗人MMP9單克隆抗體、β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶等(美國Gibco公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞周期分析試劑盒、MTT試劑、Transwell小室、Matrigel等(美國CST公司)。

1.2方法

1.2.1FK506對HCT116和SW480細胞增殖的影響 將對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細胞株HCT116和SW480鋪于96孔板中，用不同濃度FK506(10、50、100、200、400 μg/L)處理HCT116和SW480細胞，對照組不用FK506處理，每個藥物濃度處理組設(shè)7個復(fù)孔，加入藥物孵育24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，移除MTT試劑后，再加入DMSO振蕩10 min，用酶標儀在波長490 nm處測定吸光度值，計算HCT116和SW480細胞增殖抑制率，增殖抑制率=1-(實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)。根據(jù)FK506處理HCT116和SW480細胞24 h對HCT116和SW480細胞生長抑制的IC50選擇后續(xù)實驗的FK506濃度，分別為100 μg/L和200 μg/L。

1.2.2HCT116和SW480細胞分組 將HCT116和SW480細胞分為對照組(0 μg/L FK506處理)、FK506組1(100 μg/L FK506處理)和FK506組2(200 μg/L FK506處理)。

1.2.3HCT116和SW480細胞周期測定 取3組對數(shù)生長期HCT116和SW480細胞接種到10 cm培養(yǎng)皿中(濃度為2×105個/ml)，每組設(shè)7個復(fù)孔，分別用0、100、200 μg/L KF506處理，48 h后，胰蛋白酶消化細胞，離心(2 000 r/min)5 min收集細胞，加入乙醇過夜固定，加入RNA酶消化，碘化丙啶染色30 min，采用流式細胞測定各組細胞周期。

1.2.4HCT116和SW480細胞侵襲、遷移能力測定 細胞遷移能力測定：取3組對數(shù)生長期HCT116和SW480細胞接種到培養(yǎng)皿中，每組設(shè)7個復(fù)孔，分別用0、100、200 μg/L KF506處理，48 h后用胰蛋白酶消化細胞，離心(2 000 r/min)5 min收集細胞。取經(jīng)FK506處理的HCT116和SW480細胞(1×105細胞)用無血清培養(yǎng)基重懸后加入到Transwell小室上室，將含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基加入到小室的下室，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室用棉簽擦去上室細胞和基質(zhì)膠，將遷移到下室的細胞用多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察放大100倍視野遷移細胞數(shù)。細胞侵襲能力測定：將Transwell上室聚碳酸酯濾膜用Matrigel包被，并置于培養(yǎng)箱中孵育2 h至基質(zhì)膠凝固，其余實驗步驟與遷移實驗相同。

1.2.5HCT116和SW480細胞Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白水平 取3組對數(shù)生長期HCT116和SW480細胞分別用0、100、200 μg/L KF506處理，每組設(shè)7個復(fù)孔，48 h后冰上收集細胞，加入RIPA裂解液裂解30 min、用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂牛奶封閉，加入Cyclin D1(1∶1 000)、MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)一抗過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯影，BioRad圖像分析系統(tǒng)分析Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白水平，目標蛋白水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1FK506對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響 HCT116和SW480細胞經(jīng)不同濃度FK506處理后24 h，與對照組比較，F(xiàn)K506濃度≤50 μg/L時對HCT116和SW480細胞增殖的抑制作用均不明顯(P>0.05)，F(xiàn)K506濃度>50 μg/L時對HCT116和SW480細胞增殖的抑制作用均明顯增加(P>0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖1、2。

FK506處理HCT116和SW480細胞24 h對HCT116和SW480細胞生長抑制的IC50分別為114.35 μg/L和121.42 μg/L，后續(xù)實驗選擇100 μg/L和200 μg/L兩種FK506濃度處理HCT116和SW480細胞。

2.2FK506對結(jié)直腸癌細胞周期的影響 與對照組比較，F(xiàn)K506組1和FK506組2 HCT116和SW480細胞G0/G1期均升高(P<0.05)，G2/M期均降低(P<0.05)；與FK506組1比較，F(xiàn)K506組2 HCT116和SW480細胞均G0/G1期升高(P<0.05)，G2/M期均降低(P<0.05)；3組HCT116和SW480細胞S期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、2，圖3、4。

圖2 FK506對結(jié)直腸癌SW480細胞增殖的影響(n=7)Fig.2 Effect of FK506 on proliferation of colorectal cancer SW480 cells (n=7)Note: Compared with the control group (FK506 0 μg/L),*.P<0.05.

2.3FK506對結(jié)直腸癌細胞侵襲遷移能力影響 與對照組比較，F(xiàn)K506組1和FK506組2 HCT116

GroupsnG0/G1G2/MSControl group761.23±3.6414.54±1.1324.23±5.12FK506 group 1769.34±3.121)10.23±1.111)20.43±5.871)FK506 group 2776.41±3.031)2)6.57±0.721)2)17.02±5.821)2)F 37.670 110.400 2.889P <0.001 <0.001 0.082

Note:Compared with the control group,1)P<0.05；compared with FK506 group 1,2)P<0.05.

圖3 流式細胞儀測定各組HCT116細胞周期Fig.3 Flow cytometry to determine cell cycle of each group of HCT116Note: A.Control group；B.FK506 group 1；C.FK506 group 2.

GroupsnG0/G1G2/MSControl group739.87±5.2526.89±3.2433.24±6.98FK506 group 1748.29±5.431)22.14±3.151)29.57±7.021)FK506 group 2757.13±5.721)2)17.73±3.171)2)25.14±6.821)2)F17.42714.4642.391P<0.001<0.0010.120

Note:Compared with the control group,1)P<0.05；compared with FK506 group 1,2)P<0.05.

圖4 流式細胞儀測定各組SW480細胞周期Fig.4 Flow cytometry to determine SW480 cell cycle of each groupNote: A.Control group;B.FK506 group 1;C.FK506 group 2.

和SW480細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均減少(P<0.05)；與FK506組1比較，F(xiàn)K506組2 HCT116和SW480細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均減少(P<0.05)。見表3、4，圖5～8。

GroupsnNumber ofinvasion(cells)Number ofmigration(cells)Control group7112.41±14.35137.46±13.26FK506 group 1776.53±11.211)93.15±12.741)FK506 group 2748.76±10.351)2)56.57±13.411)2)F48.74466.523P<0.001<0.001

Note:Compared with the control group,1)P<0.05；compared with FK506 group 1,2)P<0.05.

圖5 各組HCT116細胞侵襲、遷移能力(×100)Fig.5 Invasive and migration ability in each group of HCT116 cells (×100)Note: A.Control group；B.FK506 group 1；C.FK506 group 2.

圖6 各組SW480細胞侵襲、遷移能力(×100)Fig.6 Invasive and migration ability in each group of SW480 cells(×100)Note: A.Control group;B.FK506 group 1;C.FK506 group 2.

2.4FK506對結(jié)直腸癌細胞Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白水平的影響 與對照組比較，F(xiàn)K506組1和FK506組2 HCT116和SW480細胞Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白水平均降低(P<0.05)；與FK506組1比較，F(xiàn)K506組2 HCT116和SW480細胞Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白水平均降低(P<0.05)。見表5、6和圖9、10。

GroupsnNumber ofinvasion(cells)Number ofmigration(cells)Control group7121.14±15.41129.42±15.31FK506 group 1782.25±13.711)88.74±14.821)FK506 group 2756.35±11.741)2)61.24±15.181)2)F39.65036.099P<0.001<0.001

Note:Compared with the control group,1)P<0.05；compared with FK506 group 1,2)P<0.05.

GroupsnCyclin D1MMP2MMP9Control group70.85±0.120.89±0.140.67±0.11FK506 group 170.51±0.091)0.62±0.131)0.46±0.081)FK506 group 270.24±0.061)2)0.27±0.081)2) 0.18±0.071)2)F75.17647.30354.235P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with FK506 group 1,2)P<0.05.

圖7 各組HCT116細胞Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白Western blot電泳圖Fig.7 Western blot analysis of Cyclin D1,MMP2 and MMP9 proteins in HCT116 cellsNote: A.Control group;B.FK506 group 1;C.FK506 group 2.

GroupsnCyclin D1MMP2MMP9Control group70.96±0.110.85±0.160.98±0.15FK506 group 170.87±0.101)0.67±0.141)0.77±0.141)FK506 group 270.56±0.081)2)0.42±0.131)2)0.48±0.121)2)F32.44615.77023.428P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with FK506 group 1,2)P<0.05.

圖8 各組SW480細胞Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白Western blot電泳圖Fig.8 Western blot analysis of Cyclin D1,MMP2 and MMP9 proteins in SW480 cellsNote: A.Control group；B.FK506 group 1；C.FK506 group 2.

3 討論

免疫抑制劑FK506為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種鈣調(diào)節(jié)蛋白抑制劑，具有高度親脂性，可以和任何細胞表面受體結(jié)合，結(jié)合后可以非常容易地通過細胞膜進入細胞內(nèi)，與細胞漿中的FK506結(jié)合蛋白結(jié)合，抑制T細胞活化；FK506為新型免疫抑制劑，其免疫抑制作用強，副作用少，在肝移植等器官移植領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，可以逆轉(zhuǎn)或預(yù)防排斥反應(yīng)，提高器官移植的存活率[7，8]。近年研究發(fā)現(xiàn)其對惡性腫瘤的生長具有抑制作用[9]，如李永文等[10]研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑FK506可抑制肺癌細胞的增殖和遷移；Kawahara等[11]發(fā)現(xiàn)FK506可抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等。但FK506對結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移影響的研究尚未見報道，本文對其進行研究，通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)FK506降低結(jié)直腸癌細胞HCT116和SW480中活細胞數(shù)量，通過流式細胞儀測定發(fā)現(xiàn)FK506將HCT116和SW480細胞阻滯在G0/G1期，結(jié)合MTT測定的活細胞數(shù)量及細胞周期，分析FK506抑制HCT116和SW480細胞增殖，且呈劑量依賴性；研究同時發(fā)現(xiàn)FK506可抑制HCT116和SW480細胞的侵襲和遷移，也具有劑量依賴性。

Cyclin D1的主要功能為促進細胞增殖，Cyclin D1可結(jié)合G1使其特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4并使CDK4激活，G1期周期抑制蛋白被磷酸化，之后從E2F轉(zhuǎn)錄因子上解離，推動細胞從G1期進入到S期，從而促進細胞增殖[12，13]。目前公認Cyclin D1為一種原癌基因，Cyclin D1的過度表達可使癌細胞增殖失控，并出現(xiàn)惡性化[14]，在乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1基因過度表達。其在結(jié)直腸癌細胞中也過度表達，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，降低Cyclin D1水平可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)FK506可抑制HCT116和SW480細胞中Cyclin D1蛋白水平，F(xiàn)K506可能通過下調(diào)HCT116和SW480細胞中Cyclin D1水平，抑制HCT116和SW480細胞從G1期進入S期，從而抑制HCT116和SW480細胞的增殖。

MMP為鋅依賴性家族，主要功能為降解細胞外基質(zhì)，維持細胞外基質(zhì)的平衡狀態(tài)，在炎癥調(diào)控、組織重構(gòu)、器官發(fā)生、惡性腫瘤等的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[17，18]，其中MMP2和MMP9在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與惡性腫瘤基底膜和細胞外基質(zhì)的降解[19]。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過程涉及單個惡性腫瘤細胞的釋放，被釋放的惡性腫瘤細胞向血管轉(zhuǎn)移，滲透到血液中或者淋巴系統(tǒng)中，黏附在血管內(nèi)皮，滲透到轉(zhuǎn)移部位的組織中。MMP2和MMP9在惡性腫瘤細胞從腫瘤組織中脫離和進入轉(zhuǎn)移的組織部位過程中都具有重要意義[20，21]。惡性腫瘤細胞偽足“侵襲鉆頭”局部有穿膜蛋白酶型MMP，穿膜蛋白酶型MMP可活化MMP2，并和MMP9一起降解細胞外基質(zhì)，“侵襲鉆頭”附近的細胞外基質(zhì)一旦被降解，惡性腫瘤細胞便可向前移行。MMP2和MMP9的水平升高在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中也具有重要意義，可使細胞間連接結(jié)構(gòu)極性消失，細胞間相互作用減少，細胞移動增加，從而促進惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移[22，23]。本研究發(fā)現(xiàn)FK506可降低HCT116和SW480細胞MMP2和MMP9水平，分析FK506可能通過下調(diào)HCT116和SW480細胞中MMP2和MMP9水平抑制HCT116和SW480細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，通過體外實驗證實FK506對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲、遷移能力具有抑制作用，F(xiàn)K506抑制結(jié)直腸癌細胞增殖可能與其下調(diào)細胞中Cyclin D1水平、阻止細胞周期有關(guān)，F(xiàn)K506抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲、遷移能力可能與其下調(diào)結(jié)直腸癌細胞中MMP2、MMP9水平有關(guān)。

本文尚存不足之處，考慮FK506為免疫抑制劑，機體免疫功能抑制與惡性腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，因此本文體外實驗雖證實FK506可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，但在體內(nèi)實驗中，F(xiàn)K506是否會通過影響機體的免疫功能而影響結(jié)直腸癌的生長、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍需進行研究，從而進一步明確FK506對結(jié)直腸癌的影響。