激活TLR5和 NLRC4通路的重組鞭毛素蛋白對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞及荷瘤小鼠的影響①

張 景 李榮輝 羅 力 卓召振 袁 軍 李 偉

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴陽(yáng)550004)

據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，女性腫瘤中發(fā)病率最高的是乳腺癌，而乳腺癌的標(biāo)化死亡率(Standard mortality ratio，SMR)在所有癌癥中位列第二，緊隨肺癌之后[1]。乳腺癌對(duì)人類產(chǎn)生的威脅不容忽視，人類對(duì)于乳腺癌的研究還有待深入。Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的模式識(shí)別受體，表達(dá)于多種正常細(xì)胞，通過(guò)對(duì)病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecula patterns,PAMPs)等的識(shí)別啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)分泌細(xì)胞因子等物質(zhì)從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均有調(diào)節(jié)作用[2-5]。其中TLR5 表達(dá)于一些固有免疫細(xì)胞，鞭毛素蛋白(Flagellin)作為其唯一的配體，能夠被 TLR5 特異性識(shí)別，識(shí)別后啟動(dòng) TLR5 和 NLRC4 信號(hào)通路[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，TLR5 在人乳腺癌中高表達(dá)，并且其通路在人乳腺癌細(xì)胞中起著重要作用。這種作用主要表現(xiàn)在，激活乳腺癌細(xì)胞上的 TLR5 通路后能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而推斷出以鞭毛素蛋白激活 TLR5通路后，促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子分泌而產(chǎn)生的潛在抗腫瘤效應(yīng)[6]。另一些研究表明，鞭毛素蛋白對(duì)一部分腫瘤細(xì)胞，如胃癌細(xì)胞，不僅沒有抑制作用，反而有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[7]。但也有研究表明，在小鼠乳腺癌模型中，不同時(shí)間段注射鞭毛素蛋白治療腫瘤會(huì)起到完全相反的作用，在腫瘤早期使用鞭毛素蛋白會(huì)促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)，而腫瘤移植后8～10 d開始注射則可顯著抑制腫瘤，另外，CpG 寡核苷酸能激活 TLR9通路產(chǎn)生抗腫瘤效果，而鞭毛素蛋白與其聯(lián)用后，能顯著增強(qiáng) CpG 寡核苷酸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果[2]。

本課題組在之前的實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)鞭毛素蛋白對(duì)多種乳腺癌細(xì)胞具有抑制作用，不激活TLR5或NLRC4通路的鞭毛素蛋白也可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，對(duì)于乳腺癌4T1細(xì)胞尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，本研究將探索激活TLR5和NLRC4通路對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖及荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，為我們進(jìn)一步了解鞭毛素蛋白在腫瘤免疫中的作用，以及利用鞭毛素蛋白進(jìn)行抗腫瘤免疫打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)，無(wú)菌PBS(博士德公司)，氨芐青霉素和鏈霉素(北京索萊寶公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，培養(yǎng)瓶(美國(guó)康寧)，EIPTG，EBradford蛋白定量試劑盒，EMTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒DMSO(北京索萊寶公司)，酶標(biāo)儀(Thermo)，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(廈門鱟試劑有限公司)，人IL-8細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，小鼠IL-1β檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司)，LDH釋放檢測(cè)試劑盒(碧云天)，BALB/c小鼠(重慶騰鑫動(dòng)物有限公司)，表達(dá)菌株FliC，EFliC-L3A、FliCΔ90-97 和 FliCΔ90-97:L3A(中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所鄢慧民研究員惠贈(zèng))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 4T1、Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，每隔3～5 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收獲細(xì)胞備用。

1.2.2重組鞭毛素蛋白活性檢測(cè) 利用人腸上皮細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞檢測(cè)TLR5通路激活，將培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞傳代接種至24孔板，約2×105個(gè)/孔，10%FBS高糖DMEM，37℃，5%CO2培養(yǎng)5 d。細(xì)胞極化好后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞饑餓8～12 h后，吸棄培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基將純化后鞭毛素蛋白稀釋成10 μg/ml，每組3個(gè)重復(fù)，刺激6 h發(fā)收集上清，檢測(cè)IL-8的濃度(詳細(xì)步驟參見人IL-8細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書)。

利用小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞檢測(cè)NLRC4通路的激活：小鼠摘眼球放血，脫頸椎處死，75%酒精消毒腹部，放入超凈臺(tái)中，從胸骨劍突處V型剪開小鼠皮毛，向下撕開鼠皮至盆骨處，暴露整個(gè)腹壁，腹腔注射10 ml RPMI1640培養(yǎng)基和適量空氣，雙手緊握小鼠頸部和尾部，劇烈振蕩20次，使腹腔巨噬細(xì)胞充分洗脫下來(lái)。在劍突下方剪一小口，用巴氏吸管插入腹腔，吸取灌洗液，注意不要有血液污染。灌洗液離心后棄上清后加1 ml 10%FBS的RPMI1640，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞鋪于96孔板。過(guò)夜培養(yǎng)后，用 RPMI1640 洗去未貼壁的非巨噬細(xì)胞，加入50 μl RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后的LPS(50 ng/ml) 預(yù)處理3 h，輕輕用PBS清洗一遍。加入200 μl 3%FBS的RPMI1640稀釋后的鞭毛素蛋白(10 μg/ml) 刺激20 h，以上均嚴(yán)格無(wú)菌操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h陽(yáng)性對(duì)照孔加入1%體積的LDH，收集上清檢測(cè)IL-1β和LDH(詳細(xì)步驟參見人IL-1β、LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書)。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 配制鞭毛素蛋白，使其濃度為2 μg/ml，充分渦旋混勻，注意無(wú)菌操作,然后相應(yīng)鞭毛素蛋白孔加入100 μl,充分吹散細(xì)胞，混勻，牛鮑氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4×104個(gè)/ml，每孔加100 μl,即每孔細(xì)胞數(shù)為4 000個(gè),37℃ 5%CO2培養(yǎng)70 h。然后每孔加入10 μl的MTT 試劑,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。800 r/min離心5 min,輕輕甩掉上清，加入150 μl DMSO,37℃10 min或室溫?fù)u床10 min 使甲臜充分溶解,測(cè)定OD490 nm值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(空白組OD值-處理組OD值)/空白組OD值×100%。

1.2.4鞭毛素蛋白對(duì)荷瘤小鼠的影響 雌性BALB/c 6～8周齡小鼠先觀察3～5 d確認(rèn)小鼠無(wú)異常后開始正式實(shí)驗(yàn)，將30只小鼠隨機(jī)分為6組，分別是Control組、生理鹽水(Normal Saline，NS)組、FliC組、FliCΔ90-97組、FliCΔL3A組和FliCΔ90-97：L3A組，Control組小鼠不作任何處理，其余小鼠乳腺部位皮下注射乳腺癌4T1細(xì)胞3.5×105個(gè)/只，建立乳腺癌腫瘤模型，造模第7天起分別腹腔注射鞭毛素蛋白或生理鹽水，隔天一次，共10次，并記錄小鼠腫瘤大小、體重變化。其中測(cè)量腫瘤大小的方法是用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量長(zhǎng)徑(L)和短徑(D)，并用公式V=L×D2/2 計(jì)算腫瘤體積大小。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所得結(jié)果的比較采用Oneway ANOVA和t檢驗(yàn)共同分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組鞭毛素蛋白的活性檢測(cè) 四種重組鞭毛素蛋白刺激Caco-2細(xì)胞系，結(jié)果顯示能夠激活TLR5通路的全長(zhǎng)FliC組和FliC-L3A組IL-8分泌分別為(540.62±46.05)pg/ml和(357.48±32.32) pg/ml與對(duì)照組(32.68±2.49)pg/ml相比有顯著差異(P<0.01)，而不能激活TLR5通路的FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A組IL-8分泌與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1A)。

四種重組鞭毛素蛋白刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，鞭毛素蛋白激活NLRC4炎癥小體后，不僅可以導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-8的分泌，同時(shí)還可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，這種凋亡是依賴Caspase-1蛋白的，使胞質(zhì)中的LDH釋放出來(lái)。結(jié)果顯示，全長(zhǎng)FliC和FliCΔ90-97分泌IL-1β分別為(1 656.26±160.71)pg/ml、(1 039.18±151.5)pg/ml，與對(duì)照組(62.91±19.17)pg/ml相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相反FliC-L3A組和FliCΔ90-97:L3A組與對(duì)照組相比IL-1β釋放無(wú)差異(P>0.05)(圖1B、C)。

2.2MTT法檢測(cè)不同濃度重組鞭毛素蛋白對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的抑制作用 由圖2可知，四種鞭毛素蛋白在1 μg/ml的濃度下，兩條通路都不激活的FliCΔ90-97對(duì)4T1細(xì)胞的抑制率達(dá)到38.84%,高于全長(zhǎng)的FliC(35.53%)、FliC-L3A(36.33%)和FliCΔ90-97：L3A(37.64%)，說(shuō)明鞭毛素蛋白抑制4T1細(xì)胞增殖可能通過(guò)其他途徑。經(jīng)Graphpad 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 四種鞭毛素蛋白對(duì)4T1細(xì)胞的抑制作用與Control組相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照(抑制率為44.87%)。

圖1 四種重組鞭毛素蛋白激活TLR5和NLRC4通路的活性檢測(cè)Fig.1 Bioactivity activating TLR5 and NLRC4 pathways of four recombinant flagellinsNote: **.P<0.01.

圖2 重組鞭毛素蛋白抑制4T1細(xì)胞的增殖Fig.2 Recombinant flagellins inhibit proliferation of 4T1Note: **.P<0.01.

圖3 小鼠體重變化趨勢(shì) Fig.3 Variation tendency of mice weight

圖4 小鼠腫瘤體積變化Fig.4 Variation tendency of tumor volumeNote: *.P<0.05.

2.3各組小鼠體重變化及總體身體情況 如圖3所示，用天平測(cè)量小鼠體重并監(jiān)測(cè)體重變化。注射鞭毛素蛋白(圖3中第7天)前，各組小鼠體重呈上升趨勢(shì)，而開始免疫后，各組體重均有不同程度的下降，后續(xù)有一定波動(dòng)，最終，F(xiàn)liC組的平均體重最輕約為17.34 g，F(xiàn)liCΔ90-97：L3A組18.08 g,FliCΔ90-97組18.47 g,FliC-L3A組19.13 g，NS組18.78 g,Control組體重最重為19.75 g。從生活狀態(tài)觀察，Control組小鼠飲食及精神狀態(tài)正常，鞭毛素蛋白組稍差，NS組自發(fā)活動(dòng)減少，靜臥不動(dòng)，背毛粗糙。直至實(shí)驗(yàn)第28天，為小鼠處死時(shí)間，統(tǒng)一處死小鼠后得到各組最終生存率。 Control組為未接種腫瘤的空白對(duì)照組，其最終生存率為 100%,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒有小鼠死亡，其次是鞭毛素蛋白組,其最終生存率為60%，NS組最終生存率為 20%(數(shù)據(jù)沒有展示)。

2.4各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況 如圖4所示，與NS組相比,19 d后，F(xiàn)liC組、FliCΔ90-97:L3A組和FliC-L3A組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)均有顯著抑制作用(P<0.05)。但是，F(xiàn)liCΔ90-97組卻沒有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(P>0.05)。FliC-L3A、 FliCΔ90-97:L3A和FliC三組對(duì)腫瘤的抑制沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論

鞭毛素蛋白的相關(guān)研究主要基于其佐劑功能和抗腫瘤作用，近年來(lái)可以被胞內(nèi)NLRC4識(shí)別的分子機(jī)制被逐漸闡明。鞭毛素蛋白可以通過(guò)激活乳腺癌細(xì)胞上的TLR5抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[8]，NLRC4炎癥小體在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9]，另外鞭毛素蛋白能夠增強(qiáng)腫瘤的放療敏感性[10]，雖然鞭毛素蛋白對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有直接的抑制作用，如乳腺癌、肺癌等[11,12]，但是腫瘤細(xì)胞對(duì)于鞭毛素蛋白的反應(yīng)性不盡相同，這不僅僅和TLR5的亞細(xì)胞定位有關(guān)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，鞭毛素蛋白和腫瘤細(xì)胞同時(shí)注射產(chǎn)生的效應(yīng)與鞭毛素蛋白在腫瘤細(xì)胞之后注射產(chǎn)生的效應(yīng)相反，可能與激活TLR5和NLRC4導(dǎo)致的細(xì)胞因子分泌情況的差異，誘導(dǎo)出不一樣的免疫應(yīng)答有關(guān)[13,14]。提示鞭毛素蛋白可以通過(guò)激活TLR5和(或)NLRC4兩條信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤的作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期的工作發(fā)現(xiàn)鞭毛素蛋白能夠激活人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的TLR5通路，并分泌IL-8等細(xì)胞因子[13]。

4T1細(xì)胞系是構(gòu)建小鼠乳腺癌動(dòng)物模型常用的細(xì)胞系。通過(guò)體外研究重組鞭毛素蛋白對(duì)4T1細(xì)胞系的影響，可以為我們利用小鼠乳腺癌模型研究TLR5和NLRC4兩條通路在腫瘤免疫中的影響打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)表明，重組鞭毛素蛋白體外對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞有抑制作用，我們課題組前期也發(fā)現(xiàn)重組鞭毛素蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和MDA-231細(xì)胞均有顯著的抑制作用[15]。這說(shuō)明重組鞭毛素蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系和小鼠乳腺癌細(xì)胞系均有顯著的抑制作用，而且這種抑制作用與TLR5和NLRC4通路的激活無(wú)顯著相關(guān)性。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各鞭毛素蛋白對(duì)乳腺癌的抑制作用與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致，由于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組鞭毛素蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞系4T1的能力無(wú)顯著差異，所以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組間的差異可能與體內(nèi)TLR5和NLRC4通路的激活密切相關(guān)。當(dāng)只激活NLRC4通路，鞭毛素蛋白不能抑制腫瘤的增殖。說(shuō)明體內(nèi)NLRC4通路的激活減弱了鞭毛素蛋白抑制腫瘤增殖的能力。只激活TLR5通路和同時(shí)激活TLR5和NLRC4通路都不能顯著增強(qiáng)FliCΔ90-97:L3A蛋白抑制腫瘤增殖的能力，說(shuō)明體內(nèi)TLR5通路的激活并不能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫細(xì)胞的殺傷腫瘤的能力。先前我們認(rèn)為重組鞭毛素蛋白對(duì)腫瘤的抑制作用有直接作用和間接作用之分，可以通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，也可通過(guò)對(duì)免疫系統(tǒng)的間接作用促進(jìn)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鞭毛素蛋白激活荷瘤小鼠體內(nèi)的TLR5和NLRC4兩條通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有不同的影響。FliCΔ90-97組腫瘤體積與NS組相當(dāng)，說(shuō)明在體內(nèi)單獨(dú)激活NLRC4通路并不能有效抑制乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)，其原因還需進(jìn)一步研究。因此，我們?cè)诶帽廾氐鞍卓鼓[瘤的同時(shí)，應(yīng)盡量避免其激活體內(nèi)的NLRC4通路。鞭毛素蛋白作用后小鼠的存活率與NS組相比明顯增高，說(shuō)明鞭毛素蛋白能提高荷瘤小鼠的存活率(數(shù)據(jù)未展示)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們進(jìn)一步了解鞭毛素蛋白在腫瘤免疫中的作用，以及利用鞭毛素蛋白進(jìn)行抗腫瘤免疫打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。