H2S通過調(diào)控iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸對(duì)尿源性膿毒血癥所致急性腎損傷的保護(hù)作用研究①

唐亞純 許武軍 陳 仙 王斌輝 郭 濤 吳孝斌 符 浩

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院泌尿外科，衡陽(yáng)421002)

尿源性膿毒血癥是由泌尿生殖系統(tǒng)感染引起的一種全身性惡性炎癥反應(yīng)綜合征[1]。近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，抗感染治療以及器官功能支持療法獲得快速發(fā)展，但尿源性膿毒血癥患者死亡率依然較高[2]。腎臟是尿源性膿毒血癥患者最易受損的臟器之一，急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是膿毒血癥常見的一種重癥并發(fā)癥，由膿毒血癥誘導(dǎo)的AKI死亡率可高達(dá)75%左右[3]。硫化氫(H2S)作為繼NO和CO之后公認(rèn)的第3種氣體信號(hào)分子，其被證明參與機(jī)體多種生理病理過程。例如，外源性H2S能夠通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)改善內(nèi)毒性急性肺損傷[4]。通過抗心肌細(xì)胞凋亡，H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用[5]。其還通過調(diào)控miR-21表達(dá)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)肺成纖維化細(xì)胞凋亡[6]。而目前，H2S對(duì)尿源性膿毒血癥誘發(fā)AKI的保護(hù)作用研究還尚未見報(bào)道。本研究通過建立兔上尿路大腸桿菌感染所致的膿毒血癥模型，探究iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸在H2S保護(hù)尿源性膿毒性AKI中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌種 40只雄性新西蘭大耳白兔，體重(2.0±0.2)kg，購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。實(shí)驗(yàn)開始前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先在動(dòng)物室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食，環(huán)境濕度45%～60%，溫度(23±2)℃。大腸桿菌(ATCC25922)由南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院微生物室提供。

1.1.2主要藥品及試劑 H2S供體NaHS和H2S合成酶抑制劑PAG購(gòu)自Sigma公司；IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢Bio-swamp公司；DAPI染液、活性氧ROS檢測(cè)熒光探針DHE購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；全蛋白提取、BCA法蛋白定量測(cè)定試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(顯色法)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所；抗iNOS、HO-1、Bax、cleaved-Caspase3及GAPDH鼠一抗和山羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自Abcam。

1.2方法

1.2.1尿源性膿毒血癥動(dòng)物模型的構(gòu)建 40只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、假手術(shù)組(Sham)、尿源性膿毒血癥模型組(Model)、H2S供體NaHS處理組(8.4 μmol/kg NaHS)和H2S合成酶抑制劑DL-炔丙基甘氨酸處理組(37.5 mg/kg PAG)，每組8只。對(duì)照組8只白兔給予正常飼料和水喂養(yǎng)，不做處理。采用腎盂高壓法模擬臨床上尿路梗阻并感染構(gòu)建尿源性膿毒血癥動(dòng)物模型[7]。造模前腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉動(dòng)物，假手術(shù)組白兔麻醉后左下腹腹直肌旁切口打開，腹腔分離出左輸尿管中段，腸管復(fù)位后關(guān)閉并縫合切口。其余3組共24只白兔麻醉后分離并結(jié)扎左側(cè)輸尿管中段，將108ml-1濃度的大腸桿菌懸液注入輸尿管管腔內(nèi)，注射濃度為0.5 kg/ml。NaHS處理組在造模后經(jīng)耳緣靜脈按8.4 μmol/kg劑量注射50 mmol/L的NaHS溶液；PAG處理組在造模后經(jīng)耳緣靜脈按37.5 mg/kg劑量注射PAG溶液；模型組則注射等量生理鹽水。所有白兔術(shù)后給予正常顆粒飼料和水喂養(yǎng)。術(shù)后72 h 將所有白兔安樂死，動(dòng)脈取血，取適量腎臟組織固定于4%多聚甲醛中用于組織病理學(xué)檢測(cè)以及取適量置EP管中保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2腎組織HE染色 取適量4%多聚甲醛固定48 h的腎臟組織,石蠟包埋制作病理切片(厚度3～5 μm)。將石蠟切片經(jīng)脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍(lán)化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察組織變化情況并攝片。

1.2.3血液指標(biāo)檢測(cè) 各組白兔靜脈取血5 ml，3 000 r/min，離心10 min，取上清。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腎功能，即血肌酐(Serum creatinine，Scr)和尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)水平。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4腎組織ROS水平檢測(cè) 按說明書操作，以DMSO溶解ROS檢測(cè)熒光探針DHE為5 mmol/L的溶液，避光放置備用；取凍存的腎組織用冰凍切片機(jī)，切片(厚度5～6 μm)；制片后，按1∶1 000的比例將稀釋好的探針溶液滴加到組織中，37℃孵育30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去多余探針溶液，用抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下，用藍(lán)光激發(fā)，觀察和拍攝細(xì)胞紅色發(fā)散圖像，ROS陽(yáng)性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色；比較各組腎組織ROS陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度(間接反映ROS水平)。

1.2.5TUNEL染色 取適量4%多聚甲醛固定48 h的腎臟組織，用流水沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)；梯度濃度的乙醇逐級(jí)脫水；依次經(jīng)透明、浸蠟、包塊后切片機(jī)上進(jìn)行切片(厚度為4～5 μm)；將切好的片子依次進(jìn)行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用PBS沖洗3次；加入50 μl轉(zhuǎn)化劑POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μl DAB底物，于15℃～25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；蘇木素復(fù)染、脫水、透明；封片，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取-80℃凍存的腎組織，采用組織全蛋白提取試劑盒分別進(jìn)行蛋白提??；用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)所提蛋白進(jìn)行濃度檢測(cè)；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗(iNOS，1∶1 000；HO-1，1∶1 000；Bax，1∶2 000；cleaved Caspase3，1∶2 000及GAPDH，1∶1 000)在4℃下孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標(biāo)記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Quantity One圖像處理軟件對(duì)各指標(biāo)灰度值進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1NaHS對(duì)尿源性膿毒血癥兔腎臟組織病理學(xué)的影響 藥物干預(yù)72 h后，對(duì)照組和假手術(shù)組兔腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)典型病理學(xué)損傷，無(wú)充血以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組兔腎小球嚴(yán)重變形，腎曲小管濁腫變形壞死，腎小管管腔變大，腎間質(zhì)充血、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，NaHS處理后上述變化顯著減輕，而經(jīng)PAG處理后的兔腎組織病理學(xué)損傷進(jìn)一步加重。見圖1。

2.2NaHS處理顯著改善尿源性膿毒血癥兔腎功能 藥物干預(yù)72 h后，對(duì)照組與假手術(shù)組兔血清BUN和Scr水平無(wú)顯著差異；模型兔血清中BUN和Scr水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔血清中BUN和Scr水平顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔血清中BUN和Scr水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3NaHS處理顯著抑制尿源性膿毒血癥兔炎癥反應(yīng) 藥物干預(yù)72 h后，對(duì)照組與假手術(shù)組兔血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平無(wú)顯著差異；模型兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔血清中IL-1β、IL-6、TNFα水平顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔血清中IL-6、TNF-α水平進(jìn)一步升高(P<0.05)。見表2。

2.4NaHS處理顯著抑制尿源性膿毒血癥兔腎組織ROS釋放 藥物干預(yù)72 h后，對(duì)照組與假手術(shù)組兔腎組織ROS水平無(wú)顯著差異；模型組兔腎組織ROS水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔腎組織ROS水平顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔腎組織ROS水平進(jìn)一步升高(P<0.01)。見圖2。

圖1 HE染色檢測(cè)兔腎臟組織病理學(xué)變化(×200)Fig.1 Histopathological changes of rabbit kidney were observed by HE staining (×200)Note: PAG.DL-Propargylglycine.

GroupsBUN (mmol/L)Scr (μmol/L)Control3.84±0.5245.61±3.24Sham3.97±0.4747.04±4.05Model12.34±0.621)104.35±6.711)Model+NaHS7.15±0.512)68.75±5.122)Model+PAG15.87±0.663)127.89±5.783)

Note:1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01,3)P<0.05 vs model group.

GroupsIL-1βIL-6TNF-αControl47.22±4.5631.45±3.27101.87±6.47Sham48.59±4.2733.46±2.89105.64±5.99Model156.13±8.781)166.78±9.041) 378.56±25.641)Model+NaHS101.25±5.372)97.48±5.782) 214.36±18.482)Model+PAG167.48±9.17 190.73±11.783)419.61±3413)

Note:1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01，3)P<0.05 vs model group.

圖2 熒光顯微鏡觀察兔腎組織ROS水平(×200，n=3)

Fig.2 ROS level of rabbit kidney tissue was determined by immunofluorescence (×200,n=3)

Note: **.P<0.01 vs sham group;##.P<0.01 vs model group.

圖3 TUNEL染色檢測(cè)兔腎組織細(xì)胞凋亡(×200，n=3)

Fig.3 TUNEL assay detected apoptosis in rabbit kidney tissue cells (×200,n=3)

Note: **.P<0.01 vs sham group;##.P<0.01 vs model group.

2.5NaHS處理顯著抑制尿源性膿毒血癥兔腎組織細(xì)胞凋亡 藥物干預(yù)72 h后，對(duì)照組與假手術(shù)組兔腎組織細(xì)胞凋亡水平無(wú)顯著差異；模型組兔腎組織細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔腎組織細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.01)。見圖3。

2.6iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸參與NaHS對(duì)膿毒血癥腎損傷的保護(hù)作用 藥物干預(yù)72 h后，對(duì)照組與假手術(shù)組兔腎組織各指標(biāo)蛋白水平無(wú)顯著差異；模型組兔腎組織iNOS、HO-1、Bax及cleaved-Caspase3蛋白水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；

圖4 兔腎組織中iNOS、HO-1、Bax和cleaved Caspase 3蛋白水平的變化Fig.4 Changes in iNOS,HO-1,Bax and cleaved Caspase 3 protein levels in rabbit kidney tissuesNote: **.P<0.01 vs sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

與模型組比較，NaHS處理后兔腎組織iNOS、Bax及cleaved-Caspase3蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，HO-1蛋白水平顯著升高(P<0.01)；而PAG處理后兔腎組織iNOS、Bax及cleaved-Caspase3蛋白進(jìn)一步升高(P<0.01)，HO-1蛋白水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

3 討論

膿毒血癥是指機(jī)體被致病菌所感染、致病菌進(jìn)而產(chǎn)生一系列毒素并被釋放到機(jī)體的血液循環(huán)中，激活內(nèi)皮細(xì)胞等防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)全身性炎癥反應(yīng)的綜合征[8]。其中，AKI是膿毒血癥的臨床常見并發(fā)癥，其可導(dǎo)致患者住院時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率增加，加重病患家庭的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。目前，膿毒血癥所致AKI的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但大多數(shù)研究認(rèn)為膿毒血癥并發(fā)AKI與血流動(dòng)力學(xué)的改變、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素、免疫抑制和細(xì)胞凋亡所致的機(jī)體功能紊亂等因素密切相關(guān)，而炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是眾多致病因素的核心因素[9]。抑制機(jī)體以炎癥為主所介導(dǎo)的一系列免疫反應(yīng)可能為有效治療膿毒血癥AKI提供新的治療策略。

H2S是繼NO和CO后的第3個(gè)氣體信號(hào)分子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如對(duì)抗缺血性損傷、減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)等，其在多種疾病狀態(tài)中顯示了極大的治療性應(yīng)用前景[10]。本研究中膿毒血癥兔造模72 h后血清BUN、Scr濃度顯著升高，說明兔腎功能受到損傷，提示膿毒血癥造模成功；腎組織損傷的典型病理學(xué)變化及血清中顯著提升的炎癥因子水平說明發(fā)生了AKI。此外，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生顯著，表現(xiàn)為ROS水平顯著升高；腎組織細(xì)胞凋亡率明顯上升，細(xì)胞功能受損。經(jīng)H2S供體NaHS治療后的膿毒血癥兔腎功能得到明顯改善，炎癥因子水平明顯降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解，細(xì)胞凋亡得到抑制，病變的腎組織學(xué)形態(tài)趨于正常。而經(jīng)H2S合成酶抑制劑PAG處理的膿毒血癥兔腎組織損傷情況進(jìn)一步加重。提示外源性NaHS進(jìn)入機(jī)體后補(bǔ)償生成H2S發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)對(duì)抗腎損傷，而PAG進(jìn)入血液循環(huán)后則抑制了機(jī)體H2S的生成加重腎損傷。說明H2S的適當(dāng)補(bǔ)充對(duì)膿毒血癥所致AKI具有顯著的治療作用。

iNOS為非Ca2+依賴型一氧化氮合酶，在正常生理情況下無(wú)活性表達(dá)，病理狀態(tài)下可在內(nèi)毒素及多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)后高表達(dá)，催化機(jī)體產(chǎn)生大量的內(nèi)源性NO，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，影響細(xì)胞的代謝及功能[11]。HO-1是HO唯一的誘導(dǎo)型，又稱為熱休克蛋白，其能催化血紅素降解產(chǎn)生游離二價(jià)鐵離子、CO和膽綠素/膽紅素，在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化和抗炎作用[12]。研究顯示H2S與機(jī)體其他信號(hào)分子NO和CO的調(diào)控存在相互作用。例如，陳濤等[13]證實(shí)外源性H2S對(duì)阿爾茲海默癥大鼠海馬iNOS/NO體系具有抑制作用，而對(duì)HO-1/CO體系有激活效應(yīng)。而在心肌炎小鼠模型中，Hua等[14]發(fā)現(xiàn)H2S所發(fā)揮的保護(hù)作用同樣與下調(diào)iNOS、上調(diào)HO-1的表達(dá)有關(guān)。在Ⅰ型糖尿病大鼠模型中，H2S干預(yù)明顯減輕了腎超微結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制被證實(shí)與有效降低iNOS蛋白表達(dá)有關(guān)[15]。而本研究中的Western blot結(jié)果顯示，H2S干預(yù)同樣下調(diào)iNOS并上調(diào)了HO-1的表達(dá)。此外，H2S所介導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用在多種疾病模型中被發(fā)現(xiàn)。例如，在腎臟缺血/再灌注損傷模型中，H2S在一定程度上保護(hù)了損傷腎組織，通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制腎組織細(xì)胞的凋亡[16]。在大鼠心臟停搏模型中，H2S可以抑制心臟停搏模型大鼠自主循環(huán)恢復(fù)后神經(jīng)元自噬，減少神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能[17]。在大鼠腸缺血/再灌注損傷模型中，H2S被證明通過下調(diào)ERK的mRNA表達(dá)及磷酸化，上調(diào)JNK、p38MAPK mRNA的表達(dá)，促進(jìn)JNK、p38MAPK、NF-κB磷酸化，從而減輕損傷大鼠的回腸上皮細(xì)胞凋亡[18]。而本研究顯示，H2S對(duì)于腎組織細(xì)胞凋亡同樣具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激，抑制凋亡信號(hào)通路Bax/Caspase3有關(guān)。

綜上，H2S對(duì)尿源性膿毒血癥誘導(dǎo)的AKI有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與有效調(diào)控iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸減少炎癥因子、iNOS的表達(dá)及ROS的釋放、促進(jìn)HO-1表達(dá)，進(jìn)而抑制損傷腎組織的細(xì)胞凋亡有關(guān)。