PAI/ITI雙模態(tài)PtCu納米框架介導(dǎo)光熱-放療聯(lián)合消融腫瘤實驗研究

李曉楠，李景華，李星星，鮑建峰

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽 471003； *通訊作者 李景華 anubiss1860@163.com

惡性腫瘤是威脅人類生命健康的重要疾病，對其可視化診療是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c[1]。多模態(tài)納米影像探針的研究為腫瘤精準(zhǔn)診療提供新策略。研究者利用納米材料優(yōu)異的理化性能，使納米材料在實現(xiàn)影像診斷的同時，具有可設(shè)計的個性化腫瘤治療能力[2]。光熱治療（photothermal therapy，PTT）是目前熱門的新型腫瘤手段，利用具有近紅外（near-infrared，NIR）光熱轉(zhuǎn)換性能的金[3]、石墨烯[4]、普魯士藍(lán)[5]、聚多巴胺[6]以及黑色素[7]等納米材料實施光熱治療，可選擇性地殺傷腫瘤而不損傷周圍正常組織，具有更高的生物相容性和治療安全性，是一種理想的腫瘤診療新手段[8]。本研究制備葉酸修飾的凹八面體 PtCu納米框架，利用葉酸的靶向作用將材料遞送至腫瘤部位，利用PtCu納米框架可吸收NIR光的性質(zhì)進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換，同時通過Pt的重原子效應(yīng)實施增強放療，在NIR激光和X射線輻照下實現(xiàn)協(xié)同消融HeLa腫瘤細(xì)胞[9]；繼而考察PtCu納米框架的體內(nèi)外光聲成像/紅外熱成像雙模態(tài)成像性能，以實現(xiàn)治療過程監(jiān)測的可視化，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 乙酰丙酮鉑[Pt（acac）2，99%]，乙酰丙酮銅[Cu（acac）2，99%]，油酸（OAM，80%～90%），十六烷基三甲基溴化胺（CTAB，99%）及葉酸（99%）購置于Sigma公司（美國），巰基-聚乙二醇-氨基（SH-PEG-NH2，Mw≈5000）購買于Jenkem公司（美國），其他常用化學(xué)試劑購置于阿拉丁公司（中國）；掃描電子顯微鏡（Nova 400-TEM，飛利浦，荷蘭）、球差校正透射電子顯微鏡（Titan G2 80-200，賽默飛，美國）。

1.2 PtCu納米框架的制備和表征

1.2.1 PtCu納米框架制備 利用熱溶劑法乳制備PtCu納米框架。將 36.7 mg Pt（acac）2和 129.4 mg Cu（acac）2共同溶解于20 ml油酸，N2保護(hù)下繼續(xù)加入660 mg CTAB，攪拌至完全溶解，將上述淺黃色溶液加入50 ml聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜中，于175℃條件下持續(xù)反應(yīng)48 h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，以8000 r/min離心，即得黑色PtCu納米框架。

1.2.2 PtCu納米框架接枝聚乙二醇 將 1.0 mmol/L PtCu納米框架和3.0 mmol/L SH-PEG-NH2共同溶解于50 ml蒸餾水中，超聲5 min使顆粒分散，持續(xù)機械攪拌12 h。以12 000 r/min離心，用透析膜（10 kD）透析24 h，即得PEG化PtCu納米框架，記為PtCu-PEG。

1.2.3 葉酸表面修飾 將PtCu-PEG（20.0 ml，0.1 mmol/L）溶解于含0.2 mmol/L葉酸的雙蒸水中，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，50.0 mg）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，25.0 mg）反應(yīng)6 h，得葉酸修飾的 PEG化PtCu納米框架，記為 PtCu-PEGFA。

1.2.4 PtCu納米框架理化性能檢測 通過掃描電子顯微鏡和投射電子顯微鏡觀察顆粒形貌；使用NanoZS電位分析儀測量所制納米框架的表面電位情況；X射線光電子能譜（XPS）儀檢測元素構(gòu)成，光聲成像儀和NIR熱成像儀檢測PtCu-PEG-FA的光聲成像（PAI）/近紅外熱成像（ITI）雙模態(tài)體外成像情況。

1.2.5 NIR 光熱性能研究 將 200 μg/ml PtCu-PEGFA納米框架分別溶解于水（H2O）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、生理鹽水（Saline）、培養(yǎng)基（Culture medium）中，采用808 nm、5 min、2.4 W/cm2參數(shù)NIR激光進(jìn)行照射，記錄其在不同溶劑中的產(chǎn)熱情況。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人子宮頸癌 HeLa細(xì)胞用含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.4 腫瘤細(xì)胞殺傷效力檢測 將HeLa細(xì)胞分別設(shè)定為對照組、PtCu-PEG-FA組、單純 X射線放療組、PtCu-PEG-FA+X射線增強放療組、PtCu-PEGFA+NIR光熱治療組、PtCu-PEG-FA+NIR+X射線聯(lián)合治療組。實驗中NIR激光參數(shù)為808 nm、5 min、2.4 W/cm2；X射線參數(shù)為10.0 Gy、10 min。利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 體內(nèi)PAI/ITI成像性能檢測 利用光熱聲成像儀（VecoL，VisualSonics公司，加拿大）記錄不同濃度PtCu-PEG-FA納米框架的PAI信號強度。用NIR光熱成像儀（P20，F(xiàn)LIR-Systems公司，美國）檢測PtCu-PEG-FA納米框架ITI信號強度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 OriginPro（version 8.0）軟件進(jìn)行方差分析和獨立樣本t檢驗。對納米框架的體內(nèi)外PAI成像效果檢測結(jié)果進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計學(xué)分析，光熱治療協(xié)同增強放療聯(lián)合治療組與對照組、單獨增強放療組和單獨光熱治療組小鼠實體腫瘤體積組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PtCu-PEG-FA理化性能表征 顆粒呈現(xiàn)典型凹八面結(jié)構(gòu)，分散性良好，粒徑分布均勻，大?。?5.32±4.37）nm。球差透射電鏡元素分布及XPS均證實納米框架的主要構(gòu)成元素為Pt和Cu。紫外-可見光光譜結(jié)果顯示材料在NIR光區(qū)有較好的吸光性質(zhì)，可用作NIR光熱材料。PtCu-PEG-FA框架的Zeta電位為（7.80±1.54）mV，與電負(fù)性細(xì)胞膜具有較好的親和性（圖1）。

2.2 產(chǎn)熱性能表征 200 μg/ml PtCu-PEG-FA即可使體系溫度升高超過50℃，達(dá)到腫瘤熱療溫度。同時，200 μg/ml PtCu-PEG-FA納米框架在不同溶劑中均可穩(wěn)定分散，NIR輻照下均能超過50℃，實現(xiàn)有效的腫瘤光熱消融（圖2）。

圖1 材料理化性能表征。A：PtCu-PEG-FA的掃描電鏡圖；B：PtCu-PEG-FA的透射電鏡圖；C：單個PtCu納米框架的元素分布圖；D：PtCu-PEG-FA的XPS譜圖；E：PtCu-PEG-FA的近紅外吸收光譜；F：材料Zeta電位圖

圖2 PtCu-PEG-FA的光熱性能表征。A：不同濃度PtCu-PEG-FA的近紅外光熱性能表征；B：PtCu-PEG-FA在不同分散溶劑中的光學(xué)照片；C：PtCu-PEG-FA（200 μg/ml）于不同分散溶劑中的光熱性能表征（NIR參數(shù)為808 nm、5 min、2.4 W/cm2）

2.3 體外成像

2.3.1 光聲成像 不同濃度PtCu-PEG-FA在經(jīng)NIR輻照時均出現(xiàn)光聲信號，其PAI信號（紅色）隨濃度升高而增強；而雙蒸水組基本無PAI成像信號。200 μg/ml組與雙蒸水對照組相比，其信號值增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

2.3.2 紅外熱成像 不同濃度 PtCu-PEG-FA 在經(jīng)NIR輻照時顯著升溫（圖3），200 μg/ml PtCu-PEGFA即可使溶液體系升高至約60℃，達(dá)到熱殺傷腫瘤細(xì)胞的有效溫度。

圖3 多模態(tài)成像性能。A：NIR輻照下材料體外PAI成像性能，紅色部分代表PAI信號強度；B：NIR輻照下材料體外ITI成像性能，色彩代表ITI信號強度，最低溫度在偽彩圖上表現(xiàn)為黑色，最高溫部分在偽彩圖上表現(xiàn)為白色（NIR參數(shù)為808 nm、5 min、2.4 W/cm2）

2.4 細(xì)胞毒性檢測 不同治療組對HeLa細(xì)胞的殺傷效力見圖4。PtCu-PEG-FA+NIR+X射線光熱和增強放療聯(lián)合治療組較對照組、單獨PtCu-PEG-FA+X射線增強放療組和單獨PtCu-PEG-FA+NIR光熱治療組的凋亡壞死情況（Q2+Q4區(qū)）更加明顯，表明PtCu納米顆粒具有較好的光熱和放療增敏效果，能夠有效殺傷消融腫瘤細(xì)胞。

圖4 流式細(xì)胞儀測定不同治療組的細(xì)胞毒性。A～F分別為對照組、PtCu-PEG-FA組、單純X射線放療組、PtCu-PEG-FA+X射線增強放療組、PtCu-PEG-FA+NIR光熱療組、PtCu-PEG-FA+NIR+X射線聯(lián)合治療組

2.5 體外成像及實體腫瘤治療表征 結(jié)果顯示 PtCu納米框架具有良好的PAI性能，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。ITI結(jié)果顯示，材料經(jīng)NIR輻照可使瘤區(qū)溫度顯著升高，可有效殺滅腫瘤細(xì)胞。在X射線聯(lián)合治療18 d后，腫瘤體積明顯減小或完全消失，具有較好的治療效果（圖5）。

2.6 組織相容性驗證 HE結(jié)果顯示，PtCu-PEG-FA經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi) 28 d后，未對小鼠主要器官造成明顯的組織學(xué)損傷，顯示出材料具有較好的生物相容性（圖6）。

圖5 體內(nèi)成像表征及動物實體腫瘤消融表征。A：體內(nèi)腫瘤光聲成像圖；B：體內(nèi)腫瘤熱成像圖；C：各治療組18 d后取出實體腫瘤的光學(xué)照片；D：18 d內(nèi)各治療組的腫瘤體積變化表征

圖6 PtCu-PEG-FA尾靜脈注射28 d后小鼠主要器官組織切片（HE，×400）

3 討論

光熱治療法利用具有高光熱轉(zhuǎn)換效率的納米材料，經(jīng)NIR激光輻照，在瘤區(qū)原位產(chǎn)生超過40℃的高溫以熱殺傷腫瘤細(xì)胞，具有組織穿透性好、選擇性高、對正常組織損傷小等優(yōu)點[10-12]；且可根據(jù)不同影像診斷要求對納米光熱制劑進(jìn)行定制和表面改性，使其具有MRI、CT、超聲成像、活體熒光成像、光聲成像、紅外熱成像等特性，實現(xiàn)診療過程的可視化監(jiān)測[13-15]。同時，利用對納米制劑本身的理化特性還可以實現(xiàn)其他生物功能，如攜帶化療藥物進(jìn)行聯(lián)合化療，使用重金屬實現(xiàn)增強放療，利用材料的共軛π鍵開展協(xié)同光動力治療等[16]。這種多模態(tài)成像介導(dǎo)的多功能化納米腫瘤診療平臺能夠更特異性、更精準(zhǔn)和更有效地實現(xiàn)腫瘤的可視化定點消融[17]。

基于此，本研究設(shè)計開發(fā)了一種同時具有光熱和增強放療效力的PtCu納米框架。該納米框架形貌規(guī)則，粒徑分布均勻，所制備材料顯示出優(yōu)異的NIR激光光熱性能。在808 nm NIR激光輻照下，極低濃度的PtCu納米框架（200 μg/ml）即可使體系升溫超過50℃，進(jìn)而利用腫瘤的熱不耐受特性，實現(xiàn)對腫瘤病灶的選擇性殺傷；并且利用 Pt的重原子效應(yīng)實施增強放療，進(jìn)一步提高治療效率。此外，由于PtCu納米框架良好的NIR光吸收及光熱轉(zhuǎn)換特性，可用作光聲成像造影劑標(biāo)記腫瘤部位，實現(xiàn)治療過程可視化，并可用NIR成像監(jiān)控腫瘤部位的實時升溫情況，防止過熱灼傷，提高治療過程的安全性。

本研究所開發(fā)的一種PAI/ITI雙模態(tài)成像介導(dǎo)可視化納米診療平臺，基于PtCu納米框架的NIR光熱性能和增強放療性能，在PAI/ITI成像引導(dǎo)下，開展光熱-放療增敏聯(lián)合作用消融實體腫瘤，實現(xiàn)了優(yōu)于單獨光熱或單獨放療的腫瘤抑制效果。為開發(fā)同時具有診斷影像探針和腫瘤治療能力的納米診療平臺提供新思路。但實驗對材料作用細(xì)胞的靶向機制及內(nèi)吞途徑尚未完全明確；未對PtCu納米框架的組織相容性進(jìn)行評價，缺乏長效生物安全性相關(guān)評價；材料在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)、組織分布及代謝途徑均有待證實，后續(xù)將開展實驗進(jìn)行深入探索。