柚子皮黃酮提取與抗氧化性能研究

楊 尉

(浙江大學(xué)衢州研究院，浙江 衢州 324000)

黃酮類物質(zhì)是良好的天然低毒抗氧化劑，不僅對(duì)羥基有顯著的清理作用，還能夠降低血液的黏稠度，減少血栓的形成等，具有極高的藥用價(jià)值[1]。我國每年的柚子產(chǎn)量幾百萬噸，而其中柚子皮就約占整個(gè)柚子重量的20%～30%，柚子皮往往會(huì)被視為垃圾丟棄掉，浪費(fèi)了隱藏在其中的營養(yǎng)和藥用價(jià)值資源。柚子皮中含有的豐富黃酮類化合物，通過對(duì)柚子皮資源進(jìn)行合理的開發(fā)利用和深加工，能創(chuàng)造較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)價(jià)值[2]。與其他純化方法相比較，大孔樹脂吸附法工藝在富集有效成分、減少雜質(zhì)、設(shè)備便宜、成本較低、使用率較高等方面都顯示出其獨(dú)特性和優(yōu)越性,使用大孔吸附樹脂分離純化黃酮在中藥產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等領(lǐng)域具有十分寬廣的前景[3]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 原料的配制

將市售的柚子果皮剪成細(xì)小塊狀放入烘箱中，在溫度為60±1℃的烘箱下烘十八至二十個(gè)小時(shí)，烘干后將柚子皮取出用粉碎機(jī)粉碎成過60目篩，得到柚子皮粉末，密封保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 主要試劑的配制

(1) DNS試劑的配制：按照文獻(xiàn)[5]配置，在棕色瓶中存放7天后使用。

( 2)豬油準(zhǔn)備：市場(chǎng)現(xiàn)購的新鮮肥豬肉切碎 ，用中火將肥肉熬制到呈金黃色，冷卻待用。

(3)硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)定，按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

(4) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液：以蘆丁為總酮標(biāo)準(zhǔn)物， 配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[7]并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 柚子皮中黃酮類物質(zhì)的提取和濃度測(cè)定

利用浸提加攪拌提取法，準(zhǔn)確稱取5.0 g的柚子皮粉末，用70%的乙醇溶液，按20：1在50 ℃恒溫提取3h，抽濾得到黃酮類物質(zhì)的濾液，轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，再用70%的乙醇溶液定容到刻度線，得到黃酮母液(粗提物)待用。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)量黃酮類物質(zhì)的含量。量取適量的粗黃酮提取液至5 mL的比色管中，以蘆丁為總酮標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置空白對(duì)照。

1.2.4 大孔吸附樹脂吸附率和解吸附率的測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取大孔吸附樹脂1.00 g于塞口錐形瓶中，加入20 mL黃酮母液，于搖床低速振蕩24小時(shí)后，收集吸附殘夜，并按照公式(1)計(jì)算出大孔吸附樹脂在室溫下(25℃)的吸附率。

吸附率E(%)=(c1-c2)/c1×100

(1)

式(1)中:c1為吸附前黃酮粗溶液濃度/(μg/mL)；c2為吸附后濾液中黃酮濃度/( μg/mL)[25]。

將上述中的吸附飽和樹脂，放于50 mL的具塞磨口錐形瓶中，加入20 mL 的70%乙醇溶液，隨后放在搖床上振蕩解吸附24小時(shí)，然后取適量濾液，測(cè)定濾液中黃酮的濃度，按公式(2)和(3)計(jì)算解吸附量與吸附率：

W/(μg/g)=( c1-c2)×V/m樹脂

(2)

解吸率(%)=cV'/W×100

(3)

(2)式中W為黃酮的飽和吸附量/(μg/g)，c1c2分別為吸附前后黃酮濃度/(μg/mL),V為黃酮溶液體積/mL； m樹脂為樹脂質(zhì)量(g)。(3)式中：c為解吸液中的黃酮濃度/(μg/mL)； V'為洗脫液體積(mL)。

1.2.5 柚子皮黃酮類物質(zhì)抗氧化性質(zhì)研究

取10.00 mL 分離純化后的黃酮溶液，對(duì)照品為70%乙醇溶液。調(diào)節(jié)pH值為5，并在55 ℃條件下保溫一小時(shí)后加入20 g的豬油，且置于40℃條件下保溫，每隔24小時(shí)就測(cè)一次豬油的過氧化值(POV)。測(cè)定方法采用國標(biāo)GB5009.5-2003推薦的碘量法。

POV=(V樣-V空)*M*100/W油

(4)

式中:POV為過氧化值(meq/kg)；M為Na2S2O3摩爾濃度；V 樣為樣品用量(mL)； V 空為空白樣品用量(mL)；W油為油的質(zhì)量(g)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

吸光度A與蘆丁質(zhì)量濃度c( μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程如圖1所示：y=0.0144x-0.029，其相關(guān)系數(shù)R2=0．9998，有良好的線性關(guān)系。

2.2 不同樹脂的靜態(tài)吸附性能

表2 不同樹脂的性能參數(shù)

測(cè)定三種大孔吸附樹脂對(duì)柚子皮黃酮類物質(zhì)的吸附率和解吸率，其結(jié)果如表3所示。

從表3中可以看出三種樹脂各項(xiàng)指標(biāo)都不錯(cuò)，黃酮類化合物因多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鏈?zhǔn)蛊滹@弱極性，X-5樹脂是非極性樹脂對(duì)黃酮類化合物的選擇性吸附不強(qiáng)，AB-8樹脂和DM-301樹脂從極性上分析都可以用來吸附黃酮， DM-301樹脂的孔徑和孔容都優(yōu)于AB-8樹脂，實(shí)驗(yàn)證明DM-301比其他兩種樹脂更適合于柚子皮黃酮類物質(zhì)的分離純化[8]。

表3 大孔吸附樹脂對(duì)柚子皮黃酮類 物質(zhì)的靜態(tài)吸附解吸測(cè)定結(jié)果

2.3 大孔吸附樹脂DM-301的靜態(tài)吸附等溫曲線

利用粗提的黃酮原液配置一系列不同濃度的黃酮溶液，分別各準(zhǔn)確量取適量溶液加入放有1 g預(yù)處理好樹脂的磨口錐形瓶中，在室溫的條件下靜態(tài)吸附3h，然后分別移取適量的殘夜測(cè)量吸光度，并計(jì)算出樹脂的飽和吸附量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 孔吸附樹脂DM-301的靜態(tài)吸附等溫曲線

整體的趨勢(shì)是樹脂的吸附量隨著黃酮溶液濃度的增大而增大，當(dāng)濃度到達(dá)195.14 μg/mL的時(shí)候，樹脂就基本達(dá)到了吸附飽和狀態(tài)。

2.4 洗脫液及洗脫液洗脫體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔吸附樹脂的影響

分別用20 mL的30%，50%，70%，99.7%的乙醇溶液進(jìn)行振搖洗脫，收集洗脫液，測(cè)量不同濃度乙醇下的洗脫液吸光度，計(jì)算出解析率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇溶液洗脫體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂的影響

由圖3可以看出，4種體積分?jǐn)?shù)不同的乙醇溶液對(duì)大孔樹脂的解吸附率不同，這是由于被分離物質(zhì)與樹脂之間的吸附力的強(qiáng)弱不同造成的[29]，根據(jù)“相似相溶”的原理，黃酮化合物為弱極性，在4種洗脫體積分?jǐn)?shù)中乙醇濃度越高極性越低，99.7%的乙醇溶液極性最小，因此洗脫效果最佳。

2.5 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確量10.0，12.0 ，14.0 ，16.0 ，18.0 ，20.0 ，22.0 ，24.0 mL粗提的黃酮類物質(zhì)置于25 mL的容量瓶中，再以70%的乙醇溶液定容到刻度線。各量取適量配制的黃酮溶液加到裝有大孔樹脂的層析柱中吸附，然后進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，以2 mL/min的流速流出，收集流出液，取適量的流出液測(cè)量吸光度，計(jì)算出樹脂的飽和吸附量，篩選出最佳的動(dòng)態(tài)吸附濃度。

圖4 上樣濃度對(duì)吸附量的影響

由圖4可知，當(dāng)黃酮濃度為214.65 μg/mL時(shí)，DM-301樹脂的吸附濃度最大，當(dāng)超過214.65 μg/mL時(shí)，其吸附量就開始不再增加反而有下降的趨勢(shì)，一般來說濃度越高吸附量就越大，但若超過了樹脂的吸附極限，即飽和吸附量，則濃度過高就會(huì)解析，所以用DM-301大孔吸附樹脂分離純化柚子皮黃酮時(shí)黃酮濃度選214.65 μg/mL為最佳。

2.6 柚子皮黃酮類物質(zhì)的抗氧化性研究

圖5 抗氧化穩(wěn)定性對(duì)比

由圖5可得，隨著時(shí)間的延長，油脂被氧化就越明顯，且從圖5中可知柚子皮黃酮能夠改善油脂的氧化，使油脂的耐氧化得到了提高。