茶多酚對草魚肝臟和腸道影響的顯微超微觀察

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036) (安徽省合肥市第一中學(xué)，安徽 合肥 230601) (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

我國是茶葉生產(chǎn)大國，茶園種植面積達(dá)284.9萬公頃[1]，茶樹修剪產(chǎn)生的枝葉、茶葉加工產(chǎn)生的茶碎梗葉、大量夏秋茶等都可以用來提取茶多酚[2, 3]。TPs(tea polyphenols)是茶葉中多酚類物質(zhì)總稱，占其干重的20%～30%[4]，適量的TPs可顯著促進(jìn)魚類的生長，這可能與TPs促進(jìn)魚類代謝以及增強(qiáng)消化吸收能力有關(guān)[5, 6]。TPs可以降低魚類肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，提高魚類肝臟抗氧化能力[5, 7]；適量的TPs可顯著提高青魚(Mylopharyngodonpiceus)腸道脂肪酶和蛋白酶活力[6]。TPs對動物肝臟與腸道的結(jié)構(gòu)存在某些影響，例如TPs可使?fàn)I養(yǎng)型肥胖大鼠肝細(xì)胞體積增大，減小肝血竇間隙[8]，TPs還能夠提高肉鴨回腸絨毛高度，增加回腸絨毛表面積[9]。但目前缺乏TPs對魚類影響的相關(guān)研究。為此，筆者以TPs飼喂草魚，并對其肝臟和腸道進(jìn)行顯微和超微觀察，探討了TPs對魚類肝臟和腸道微觀結(jié)構(gòu)的影響，以為新型飼料添加劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚購自合肥市大興鎮(zhèn)漁場，購回后采用1%濃度食鹽水消毒7～8min，暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間，每天飽食投喂對照組飼料2次。TPs購自蕪湖天遠(yuǎn)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，純度為98.37%。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。該系統(tǒng)由單個體積為60cm×60cm×60cm(有效水體180L)的塑料水族箱與過濾池組成。養(yǎng)殖用水為曝氣自來水，水溫(28±1.0) ℃，日光燈8：00～20：00照明。

前期試驗(yàn)中以0.00%～0.40%范圍的TPs投喂草魚，其中0.05% TPs組轉(zhuǎn)化效率顯著高于其他各組，其他各組之間無顯著差異，因此取無添加對照組、添加量最高的0.40%組以及生長效果最好的0.05%組進(jìn)行比較，分別配制3種飼料?；A(chǔ)飼料(對照組)粗蛋白含量為35.7g/100g(蛋白質(zhì)主要來源為豆粕等植物蛋白)，能值15.13J/mg。飼料為粒徑2mm的顆粒飼料，65℃烘干，-20℃冰柜保存。

試驗(yàn)開始前饑餓草魚24h，每箱隨機(jī)稱取30尾放入，每種處理3個平行。初始平均體重為4.50g。每天上午9：00和下午3：00過量投喂飼料1次，1h后回收殘餌。

8周后結(jié)束生長試驗(yàn)，饑餓24h后稱量各組體重，每組取3尾試驗(yàn)魚，第一脊椎處剪斷處死，取肝臟和前腸。同一樣本分2份，1份用作顯微切片，另1份用作電鏡切片。

1.3 顯微切片制作與觀察

新鮮肝臟和前腸切小塊，投入Bouin氏固定液固定24h，70%酒精溶液浸洗，經(jīng)梯度酒精脫水，再浸在二甲苯中至透明，用石蠟透蠟和包埋，切片機(jī)切片(厚度為6μm)，經(jīng)展片和烘片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 電鏡切片制作與觀察

新鮮肝臟和前腸切修成小于1mm3的小塊，2.5%戊二醛固定2h，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定3h，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗，梯度酒精脫水，Epon 812樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，采用日立HT7700型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TPs對草魚肝臟結(jié)構(gòu)的影響

3組草魚的肝臟顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示。可見各組肝細(xì)胞細(xì)胞核明顯，細(xì)胞界限明顯，但對照組肝血竇間隙最寬(圖1(a))，0.05%組肝血竇間隙最窄(圖1(b))，0.40%組有寬的肝血竇出現(xiàn)。

注：H為肝細(xì)胞；N為細(xì)胞核；RC為紅細(xì)胞；HS為肝血竇圖1 TPs對草魚肝細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)影響

3組草魚肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)如圖2所示。可見各組肝細(xì)胞膜明顯，細(xì)胞核近似橢球形，線粒體成棒狀或球形并貼近細(xì)胞核周圍的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞質(zhì)中可見數(shù)個脂肪滴。但對照組與0.40%組肝細(xì)胞胞質(zhì)中脂肪滴數(shù)量多體積大(圖2(a)和(c))，細(xì)胞核偏離細(xì)胞中央位置，貼近細(xì)胞膜；0.05%組肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的脂肪滴體積明顯變小(圖2(b))，細(xì)胞核略偏離中央位置。

2.2 TPs對草魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

3組草魚腸道黏膜層顯微結(jié)構(gòu)如圖3所示?？梢姼鹘M腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，紋狀緣發(fā)達(dá)。與對照組相比，2個TPs組固有膜中血管更為豐富，黏膜層上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞更多，0.40%組的杯狀細(xì)胞最多。

注：Sb為紋狀緣；Ep為上皮細(xì)胞；GC為杯狀細(xì)胞；Pr為固有膜圖3 TPs對草魚腸道黏膜層顯微結(jié)構(gòu)影響

3組草魚腸道黏膜層上皮吸收細(xì)胞游離面超微結(jié)構(gòu)如圖4所示?？梢姼鹘M微絨毛均勻緊密地分布，靠近微絨毛端的細(xì)胞質(zhì)中有線粒體分布。2個TPs組的線粒體數(shù)量明顯多于對照組，其中0.05%組最多，分布最密集。

注：Mi為線粒體；Mic為微絨毛圖4 TPs對草魚腸道吸收細(xì)胞游離面超微結(jié)構(gòu)影響

3 討論

研究表明，TPs可減輕營養(yǎng)型肥胖大鼠肝臟脂肪變性，縮小肝血竇間隙[8]。研究中，添加TPs可使草魚肝細(xì)胞排列緊密，肝血竇間隙縮小，與上述研究結(jié)果相似。但也有研究顯示，草魚肝臟出現(xiàn)損傷時，肝血竇間隙增大[10, 11]，這表明TPs可能對肝臟有一定保護(hù)作用。

已有研究顯示，適量TPs可降低魚類肝臟中脂肪相關(guān)合成基因的表達(dá)，減少肝臟中脂肪沉積[5, 12]。筆者研究則直觀地顯示0.05% TPs可明顯減小肝細(xì)胞中脂肪滴體積，明顯減少肝細(xì)胞中脂肪含量。對犬肝細(xì)胞的超微觀察顯示，TPs也減少了肝細(xì)胞中脂肪滴含量[13]。此外，研究中對照組和0.40%組肝細(xì)胞的細(xì)胞核貼近細(xì)胞膜，而0.05%組的細(xì)胞核偏移程度較小，這應(yīng)該與前兩組細(xì)胞質(zhì)中脂肪滴數(shù)量多體積大有關(guān)，營養(yǎng)性脂肪肝細(xì)胞的胞質(zhì)中充滿脂肪滴，細(xì)胞核就會被脂肪滴擠偏移位[14]。這些研究表明，TPs確實(shí)有降低肝臟脂肪含量的作用，但不同劑量效果不同。用TPs飼喂大黃魚(Larimichthyscrocea)，0.02%的劑量對肝臟的降脂作用最為顯著[12]。0.05%組的降脂效果強(qiáng)于0.40%組，可以大體推測，TPs降低肝臟脂肪需要較低的劑量即可。

魚類腸道黏膜層最上層為上皮層，該層含有吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，吸收細(xì)胞游離面具有明顯的紋狀緣(電鏡下的微絨毛)，可增加腸表面吸收面積[15]；吸收細(xì)胞本身消化功能旺盛，胞質(zhì)內(nèi)存在線粒體以提供能量[16]；杯狀細(xì)胞則主要產(chǎn)生黏蛋白，該蛋白有潤滑、保護(hù)、免疫防御、消化和吸收等多種功能[17]；同時，黏膜層的固有膜中有毛細(xì)血管輸送營養(yǎng)物質(zhì)[15, 18]。TPs對微絨毛高度及密度無明顯影響，但明顯增加了吸收細(xì)胞中線粒體數(shù)量以及杯狀細(xì)胞數(shù)量，TPs也使固有膜中的毛細(xì)血管變得更為豐富，其中0.05%組表現(xiàn)更為明顯，這些都表明TPs能夠影響腸道黏膜層的一些形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而提高腸道的消化吸收能力。