D型肉毒梭菌毒素滅鼠劑防治高原鼢鼠的試驗研究

李生慶 張西云 劉懷新 李志寧 張同作 李積良 林恭華

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧，810016；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧，810001；3.青海省祁連縣野牛溝鄉(xiāng)獸醫(yī)站，祁連，810005)

青藏高原草地具有涵養(yǎng)水源與全球氣候調(diào)節(jié)的重要作用，青藏高原草地應(yīng)以保護生態(tài)環(huán)境功能為主要目的，以生態(tài)保護發(fā)展戰(zhàn)略為優(yōu)先[1-2]。然而，近年來隨著生態(tài)環(huán)境的不斷改變，包括高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)在內(nèi)的多種害鼠對高原牧區(qū)草地植被的破壞日趨嚴重。

高原鼢鼠為鼢鼠科(Spalacidae)，鼢鼠屬的動物，體形粗圓，吻短，眼小，尾短，四肢也較短粗。成體毛色從頭部至尾部呈灰棕色，腹面較背部更暗灰色；幼體及半成體為藍灰色或暗灰色。高原鼢鼠長期生活于黑暗、封閉的環(huán)境中，不冬眠，主要采食植物的地下根系，1年繁殖1次，每胎產(chǎn)仔數(shù)1—6只，主要棲息于高寒草甸、草甸化草原、草原化草甸、高寒灌叢、高原農(nóng)田、荒坡等比較濕潤的河岸階地、山間盆地、灘地和山麓緩坡，僅分布在中國[3]。高原鼢鼠主要采食植物的地下根系，尤其喜食雜類草肥大的軸根、根莖和根蘗的地下部分，也常將植物地上部分的莖葉拖入洞道內(nèi)食用或作巢內(nèi)鋪墊之用。對于禾本科(Gramineae)植物，除少量食其根莖和嫩葉外，其他部分則很少取食。

近年來高原鼢鼠種群數(shù)量急劇增長，危害十分嚴重，發(fā)生危害面積呈擴大趨勢，對草原生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)和當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展造成了嚴重的威脅。據(jù)張生合等[4]報道，青海省鼢鼠危害面積110×104hm2，占全省草原鼠害面積的10%，其中青海玉樹、果洛和環(huán)湖地區(qū)危害最嚴重，形成了大面積寸草不生的“黑土灘”，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)張桂芳[5]報道，青海省農(nóng)田鼠害年發(fā)生13萬hm2，其中鼢鼠危害面積最大，有6.7萬hm2，鼢鼠種群密度每畝30只。2007年，高原鼢鼠危害面積31.2萬hm2，約占全州總面積的10%，密度最大的區(qū)域每畝有662個鼢鼠土堆，危害十分嚴重。

利用毒性化學(xué)藥物滅鼠可以在居民區(qū)等特殊環(huán)境中達到可觀的效力，但是在物種繁多的草地生態(tài)系統(tǒng)，化學(xué)鼠藥的毒性通過食物鏈危及嚙齒類動物的天敵香鼬(Mustelaaltaica)、艾虎(Mustelaeversmanni)、狐貍(Vulpesvulpes)等，天敵數(shù)量急劇下降，沒有天敵的抑制作用反而造成鼠類種群數(shù)量劇增[6]。物理防治利用各種物理器械(鼠夾、鼠籠及弓箭等)捕捉或殺死鼠類，減少嚙齒類種群的數(shù)量，顯然在廣袤的草原物理滅鼠的效果極為有限，所以化學(xué)、物理滅鼠不能成為草地滅鼠的主要方式。生物防治法主要是利用天敵防治鼢鼠，鼢鼠的天敵很多，主要是食肉目(Carnivora)的小型獸類如黃鼬(Mustelasibirica)、野貓、家貓、狐等，鳥類中的猛禽如鷹(Accipiter)、貓頭鷹等，鼠類天敵的繁殖技術(shù)尚未解決，面對日益猖獗的鼠害，已不能適應(yīng)新形勢下鼠害天敵防治的要求。

20世紀90年代，三江源地區(qū)的鼠害治理方法主要是化學(xué)和物理防治，即化學(xué)藥劑毒殺和人工捕殺?；瘜W(xué)藥物自20世紀60年代以來，先后更換了三代藥物。早先使用的藥物毒性大，能引起動物的二次中毒和積累中毒，從而破壞食物鏈[7]。

鑒于此，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院利用D型肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)所產(chǎn)毒素成功研制了D型肉毒滅鼠劑。并先后開展了D型肉毒滅鼠劑防治高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)、青海田鼠(Lasiopodomysfuscus)的實驗研究，取得了良好的效果，但對高原鼢鼠鼠害防治目前還普遍采用弓箭抓捕的手段，其效率低下，費工費力。本實驗室開展了D型肉毒滅鼠劑防治高原鼢鼠的實驗研究，取得了相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)，為今后利用生物毒素防治高原鼢鼠提供了可靠的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品

D型肉毒滅鼠劑(毒價：1 000萬MLD/Ml，小白鼠靜注，批號：20151003批)由青海畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供。

1.1.2 試驗動物

利用已取得的實用新型專利“高原鼢鼠活體定位捕捉儀”從青海省海北州門源縣、大通縣向華藏族鄉(xiāng)捕捉野外高原鼢鼠。

1.2 方法

1.2.1 D型肉毒滅鼠劑對高原鼢鼠半數(shù)致死量的測定

1.2.1.1 灌胃半數(shù)致死量的測定

用霍恩氏法測定LD50，以每千克體重設(shè)置2 150 MLD、4 640 MLD、10 000 MLD、21 500 MLD 4個劑量組，每組5只動物，以每100 g體重灌服215、464、1 000、2 150 MLD的毒素，試驗后正常飼喂，觀察10 d，記錄死亡情況。

1.2.1.2 口服半數(shù)致死量的測定

取鼢鼠25只，稱重后單只飼養(yǎng)于鼠籠中，分別以2.0、1.0、0.5、0.25及0.125 g/200 g體重稱取顆粒毒餌，置于平皿中，待鼢鼠采食后，轉(zhuǎn)為正常飼喂，觀察7 d，記錄鼢鼠死亡情況。采用改良寇氏法計算LD50(計算方法：LD50=log-1[Xm-i(∑P-0.5)])。

1.2.2 高原鼢鼠對D型肉毒毒餌的適口性試驗

1.2.2.1 有選擇適口性的測定

取健康鼢鼠10只，稱重后編號，放置于相應(yīng)編號桶內(nèi)，夜間放回裝有泥土的原桶內(nèi)。于每日9：00，將含有10 g D型肉毒滅鼠劑小麥毒餌(4萬MLD/g)的平皿以及含有10 g無毒小麥基餌的平皿同時放置于已編號的每只鼢鼠桶內(nèi)，每天17：00取出稱量毒餌剩余量，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.2 無選擇適口性的測定

取健康鼢鼠20只，隨機分為4組，稱重后編號，放置于相應(yīng)編號桶內(nèi)，夜間放回裝有泥土的原桶內(nèi)。

第一組(毒餌組)：于每日9：00，將含有10 g D型肉毒滅鼠劑小麥毒餌(4萬MLD/g)的平皿放置于已編號的每只鼢鼠桶內(nèi)，每天17：00取出稱量毒餌剩余量，記錄數(shù)據(jù)。

第二組(無毒組)：于每日9：00，將含有10 g無毒小麥基餌的平皿放置于已編號的每只鼢鼠桶內(nèi)，每天17：00取出稱量毒餌剩余量，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.3 再遇適口性的測定

取健康鼢鼠5只，于2016年9月25日投給亞致死量D型肉毒滅鼠劑毒餌，飼喂24 h后取出分別稱重，記錄采食量，連續(xù)飼喂3 d后，改為正常飼喂料。3 d后，分別稱取10 g 含4萬MLD/Ml D型肉毒毒素小麥毒餌放入Z01-Z05的飼養(yǎng)有前述試驗高原鼢鼠的試驗桶內(nèi)，每12 h稱重記錄毒餌剩余量，觀察記錄采食量及死亡情況。

2 試驗結(jié)果

2.1 D型肉毒毒素對高原鼢鼠灌胃試驗

D型肉毒滅鼠劑對高原鼢鼠的灌胃半數(shù)致死量LD50為5 840 MLD/kg體重，可信線為3 430—9 950 MLD(小白鼠)/kg體重。

結(jié)果：LD50為5 840 MLD/kg體重，可信線為3 430—9 950 MLD(小白鼠)/kg體重，是中等毒，表明D型肉毒毒素對高原鼢鼠敏感。

2.2 高原鼢鼠對D型肉毒毒素毒餌口服半數(shù)致死量的測定

2.2.1 高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌口服半數(shù)致死量的測定

加入毒素量為4萬MLD/g的小麥毒餌對高原鼢鼠LD50=0.17(g/200 g體重)。即LD50為0.85 g/kg體重。由此證明，小麥毒餌對高原鼢鼠敏感，且適口性良好，可以在實地應(yīng)用。LD50測定情況見表2。

表1 D型肉毒滅鼠劑對高原鼢鼠的灌胃半數(shù)致死量LD50測定

Tab.1 Determination of LD50 about D-type botulinum toxin to plateau zokor

表2 4萬MLD/g D型肉毒毒素小麥毒餌對高原鼢鼠LD50的測定

Tab.2 The LD50 Using 40 000 MLD/g D-type botulinum toxin of wheat bait to the plateau zokor

表3 D型肉毒毒素小麥毒餌對高原鼢鼠LD50的計算

Tab.3 Count of LD50 about wheat bait of D-type botulinum toxin to plateau zokor

LD50=log-1[Xm-i(∑P-0.5)]

LD50=log-1(-0.301 029 9-0.903 089 9)(1+0.6+0.2-0.5)

=log-1(-0.301 029 9-0.903 089 9)(1.3)

=log-1(-1.475)

=0.17(g/200 g體重)即LD50為0.85 g/kg體重。

2.2.2 高原鼢鼠對D型肉毒毒素顆粒毒餌口服半數(shù)致死量的測定

加入毒素量為4萬MLD/g的顆粒毒餌對高原鼢鼠LD50=0.26(g/200 g體重)。即LD50為1.30 g/kg體重。由此證明，顆粒毒餌對高原鼢鼠敏感，且適口性良好，可以在實地應(yīng)用。LD50測定情況見表4。

LD50=log-1[Xm-i(∑P-0.5)]

LD50=log-1[0.301 029-(-0.903 089(1+0.4+0.6+0.2-0.5))]

=log-1[0.301 029-(-0.903 089(1.7))]

=log-1(-1.475)

=0.26(g/200 g體重)

即LD50為1.30 g/kg體重

2.3 高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌的無選擇適口性試驗

試驗測得高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌的攝食系數(shù)(毒餌組攝食量/對照組攝食量)第1天為0.93，第2天為1.08，第3天為0.46，總計攝食系數(shù)為0.81，說明高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥適口性很好。采食毒餌第3天開始高原鼢鼠陸續(xù)死亡，也能證明對毒餌的采食性良好(表6)。

表4 4萬MLD/g D型肉毒毒素顆粒毒餌對高原鼢鼠LD50的測定

Tab.4 The LD50 Using 40 000 MLD/g D-type botulinum toxin of particle bait to the plateau zokor

表5 D型肉毒毒素顆粒毒餌對高原鼠兔LD50的計算

Tab.5 Count of LD50 about particle bait of D-type botulinum toxin to plateau zokor

表6 無選擇適口性試驗結(jié)果

Tab.6 Results of no choice palatability test

2.4 高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌的有選擇適口性試驗

攝食系數(shù)(毒餌組攝食量/對照組攝食量)第1天為1.45，第2天為1.09，第3天為1.43，總計攝食系數(shù)為1.33，說明高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌有選擇適口性很好。高原鼢鼠對D型肉毒滅鼠劑適口性很好，攝食系數(shù)為1.33(表7)。

2.5 高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌再遇適口性試驗

2.5.1 投喂亞致死量小麥毒餌后，其毒餌平均采食量分別為第1天5.18 g，第2天為8.74 g，第3天為9.84 g，說明高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌適口性良好，逐步適應(yīng)，且在試驗期內(nèi)無實驗動物死亡。

2.5.2 投喂正常防治劑量D型肉毒毒素小麥毒餌后，第1天的采食量為9.1 g，第2天8.58 g，與第1天基本相當(dāng)，第3天即有3只高原鼢鼠中毒死亡，說明在采食亞致死量D型肉毒毒素后高原鼢鼠并沒有或產(chǎn)生警戒厭食現(xiàn)象，而是繼續(xù)，直至中毒死亡，表明高原鼢鼠對D型肉毒毒素的再遇適口性良好，可用于大面積高原鼢鼠的鼠害防治。

表7 有選擇適口性試驗結(jié)果

Tab.7 Results of select palatability test

表8 高原鼢鼠對D型肉毒毒素小麥毒餌的再遇適口性試驗

Tab.8 Experiment on the palatability of wheat bait of D-type botulinum toxin to plateau zokor

3 結(jié)論

3.1 試驗測得D型肉毒梭菌毒素對高原鼢鼠的灌胃半數(shù)致死量5 840 MLD/kg體重，可信線為3 430—9 950 MLD(小白鼠)/kg體重，表明D型肉毒滅鼠劑對高原鼢鼠敏感，具備潛在的防治野外高原鼢鼠的能力。

3.2 試驗測得D型肉毒毒素顆粒毒餌、小麥毒餌口服半數(shù)致死量(LD50)分別為0.85 g/kg體重和1.30 g/kg體重。證明毒素以小麥或顆粒餌料作為基餌，其口服敏感性良好。

3.3 試驗以小麥為基餌拌制毒餌，測得高原鼢鼠對小麥毒餌的有選擇適口性良好，攝食系數(shù)為1.33；無選擇適口性很好，攝食系數(shù)為0.81；再遇適口性良好，該項試驗研究為利用D型肉毒梭菌生物毒素進行大面積高原鼢鼠的防治提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 討論

4.1 肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽胞桿菌屬，具有該菌的基本特性，即厭氧性的桿狀菌，形成芽胞，芽胞比繁殖體寬，呈梭狀，新鮮培養(yǎng)基的革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)生劇烈細菌外毒素，即肉毒毒素，可形成一種強力的毒素抑制呼吸導(dǎo)致死亡，是迄今為止所知的最毒的自然生成的毒素之一[8]。根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C(1、2)、D、E、F、G等7個型。引起人群中毒的主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報道[9]。本試驗所涉及的D8901菌株是青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院于1989年在國內(nèi)首次從動物體內(nèi)分離的一株肉毒梭菌[10]，通過對該菌株產(chǎn)毒特性的研究，為D型肉毒毒素滅鼠劑的規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4.2 D型肉毒滅鼠劑是利用D型肉毒梭菌所產(chǎn)毒素蛋白研制成的一類新型生物類滅鼠制劑，大量試驗證明該滅鼠劑對于防治高原鼠兔具有良好的效果[11]，尤其是通過三江源草地生態(tài)環(huán)境治理鼠害防治工程的實施，在利用D型肉毒滅鼠劑防治高原鼠兔方面積累了豐富的經(jīng)驗，防治技術(shù)日臻完善，但高原鼢鼠作為青藏高原牧區(qū)另一大危害鼠種，始終未能找到成功的防治方法和技術(shù)。因此，本試驗通過測定D型肉毒毒素對高原鼢鼠的灌胃半數(shù)致死量(LD50)，初步證實該滅鼠劑對高原鼢鼠極其敏感，灌胃半數(shù)致死量5 840 MLD/kg體重，可信線為3 430—9 950 MLD(小白鼠)/kg體重，另外，還進行了高原鼢鼠喜食性餌料的篩選以及害鼠對D型肉毒毒素的適口性、再與適口性等試驗，為應(yīng)用該滅鼠劑進行高原鼢鼠的大面積鼠害防治提供了相應(yīng)的技術(shù)參數(shù)。

4.3 高原鼢鼠俗稱瞎老鼠，藏民又稱塞隆。眼睛極度退化，常年生活于地底。我們推測，該鼠種對于食物的采食，很大程度上依靠其靈敏的嗅覺。因此，如何提高餌料的采食率是保證滅效的一大關(guān)鍵。針對于此，我們將青稞、燕麥、小麥以及自行研制的顆粒餌料作為基餌進行對比試驗，試驗結(jié)果證明，小麥的采食率最高，顆粒餌料次之，燕麥的采食率最低。實驗發(fā)現(xiàn)，高原鼢鼠對燕麥有嚴重的蛻皮現(xiàn)象，因此嚴重影響毒素的攝取量，故在高原鼢鼠的防治過程中要區(qū)別于高原鼠兔，避免使用燕麥作為餌料，以免影響滅效。另外，餌料選擇性試驗結(jié)果，我們推薦在大面積鼠害防治時使用小麥拌制毒餌，而在林地、中藥材種植區(qū)域采用顆粒毒餌進行鼠害防治，效果更佳。