自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響

葉 武 黃勍棟 唐婷玉 葉 芃 杜堅宗

肺癌是危害人類生命和健康的主要惡性腫瘤之一。蓽茇屬于胡椒科植物蓽茇的干燥未成熟或成熟的果穗[1]。蓽茇酰胺是一種中藥單體，存在于蓽茇根，以及瘤突胡椒和長柄胡椒根[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板凝集、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗真菌、抗血吸蟲、抗焦慮以及抗抑郁等多種藥理作用[3]。本研究旨在探討蓽茇酰胺對肺癌的抗腫瘤作用。

1 實驗材料

1.1 藥 品 蓽茇酰胺（批號S7551）購于美國Selleck chemicals 公司；2'、7'-二氯-熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，批號S0033）購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，批號S0077）購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；3-甲基腺嘌呤（批號S9281）購于美國Selleck chemicals 公司。

1.2 試劑及儀器 CCK-8 溶液（批號C008-3）購于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；α-tubulin（批號T5168）購于美國Sigma 公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3B抗體（LC3B，批號nb100）購于美國Novus Biologicals公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號P0018AS）購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；BD FACS Calibur 流式細胞儀購于美國BD 公司；超微量分光光度計購于美國Thermo Fisher Scientific 公司，凝膠電泳儀購于美國Bio-Rad 公司；化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀購于日本富士膠片公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549 細胞株（上海中國科學(xué)院細胞庫提供）接種于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 天更換培養(yǎng)基，待細胞密度為80%～90%時，用胰酶消化，進行細胞傳代。待細胞生長狀態(tài)良好，進行后續(xù)實驗。

2.2 細胞內(nèi)活性氧水平檢測 實驗分為對照組、蓽茇酰胺組和蓽茇酰胺+NAC 組。對照組采用生理鹽水處理A549 細胞48h，蓽茇酰胺組采用3μM 蓽茇酰胺處理A549 細胞48h，蓽茇酰胺+NAC 組采用3μM蓽茇酰胺和10mM NAC 處理A549 細胞48h。蓽茇酰胺或NAC 處理A549 細胞后，將細胞與10μM DCFH-DA 在37℃下孵育30min。無血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞。使用BD FACS Calibur 流式細胞儀測定熒光強度，該值代表細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 實驗分為對照組、蓽茇酰胺組，蓽茇酰胺+NAC 組和3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組。前三組處理同2.2，3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組采用3μM 蓽茇酰胺和3mM 3-甲基腺嘌呤處理A549 細胞48h。將A549 細胞（3000 個/孔）接種于96孔板中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加入蓽茇酰胺、NAC 或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤，采用超微量分光光度計測定在450nm 處各孔的吸光度（OD 值）。

2.4 蛋白質(zhì)印跡 使用細胞裂解液裂解A549 細胞，BCA 法測定蛋白濃度。取30～60μg 總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST 封閉2h，加入α-tubulin 或LC3B，4℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次，將膜置于二抗中，室溫下孵育1.5h，ECL 顯影，置入化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀曝光，采用Image J 軟件分析目的蛋白的相對灰度，計算公式為：目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料的兩組間均數(shù)比較采用Student’s t 檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組A549 細胞ROS 水平比較 蓽茇酰胺組A549 細胞ROS 水平顯著高于對照組（P＜0.05），蓽茇酰胺+NAC 組細胞ROS 水平低于蓽茇酰胺組（P＜0.05），與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1、插頁圖1。

圖1 各組A549 細胞ROS 水平比較

表1 各組A549 細胞ROS 水平比較（±s）

表1 各組A549 細胞ROS 水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05；ROS：活性氧；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.2 各組細胞活力比較 蓽茇酰胺組細胞活力顯著低于對照組（P＜0.05）。蓽茇酰胺+NAC 組與對照組細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。蓽茇酰胺與NAC 合用后，細胞活力恢復(fù)至用藥前水平，與蓽茇酰胺組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞活力比較（%，±s）

表2 各組細胞活力比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.3 各組A549 細胞LC3B-II 表達水平比較 蓽茇酰胺組細胞LC3B-II 表達顯著高于對照組（P＜0.05），蓽茇酰胺與NAC 合用后，LC3B-II 表達下降至用藥前水平。見插頁圖2。

圖2 各組A549 細胞LC3B-Ⅱ表達水平

3.4 3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組LC3B-II 表達顯著低于對照組和蓽茇酰胺組（P 均＜0.05），3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組A549 細胞活力顯著低于蓽茇酰胺組（P＜0.05）。見表3、插頁圖3。

表3 3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響（%，±s）

表3 3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05

4 討論

蓽茇酰胺屬生物堿類化合物，具有多種藥理學(xué)作用。研究表明，蓽茇酰胺選擇性地抑制腫瘤細胞而不影響正常組織[4]。Raj 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺增加腫瘤細胞的ROS 水平，但是其對正常細胞的ROS 水平無明顯影響。正常細胞基礎(chǔ)代謝水平較低，很少依賴ROS 應(yīng)激反應(yīng)途徑。腫瘤細胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，為適應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，腫瘤細胞啟動抗氧化防御系統(tǒng)，較大程度上依賴ROS 應(yīng)激反應(yīng)途徑。因此，蓽茇酰胺選擇性地增加腫瘤細胞ROS 含量，進而抑制細胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細胞凋亡[6]。本研究顯示，蓽茇酰胺提高肺癌細胞的ROS 水平，抑制細胞增殖，NAC 與蓽茇酰胺合用能逆轉(zhuǎn)蓽茇酰胺介導(dǎo)的ROS 含量升高和細胞增殖抑制作用。這提示蓽茇酰胺可能通過調(diào)節(jié)ROS 依賴途徑抑制肺癌細胞增殖。

自噬是存在于真核細胞內(nèi)的一種依賴溶酶體途徑的蛋白質(zhì)和細胞器降解過程。與肺癌、肺動脈高壓、慢性阻塞性肺病、急性肺損傷和呼吸道感染等多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5，7]。LC3B 在自噬過程中扮演重要角色，常被作為監(jiān)測巨自噬發(fā)生的特異性標志蛋白[8-9]。本研究顯示，蓽茇酰胺處理肺癌細胞，LC3B-II 表達顯著增加，與NAC 合用逆轉(zhuǎn)蓽茇酰胺介導(dǎo)的LC3B-II 升高。這提示蓽茇酰胺參與調(diào)節(jié)ROS 依賴的細胞自噬。

肺癌細胞自噬水平升高，并依賴自噬來維持細胞生長和存活所需的線粒體功能和細胞代謝[10-11]。本研究將自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤處理肺癌細胞，LC3B-II 表達顯著降低。3-甲基腺嘌呤和蓽茇酰胺聯(lián)用明顯增強蓽茇酰胺的抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺通過調(diào)節(jié)ROS依賴途徑，抑制肺癌細胞增殖，促進細胞自噬。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤降低肺癌細胞自噬，增強蓽茇酰胺的抗腫瘤作用。