縉云山不同森林植被下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征研究*

王鎣燕 王子芳 黃 容 呂 盛 高 明

(西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400715)

土壤微生物是森林土壤的重要組成部分，在有機質(zhì)形成與分解、養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化以及能量流動等方面具有重要地位［1］。其中，森林土壤微生物生態(tài)學研究，能深入了解森林土壤中營養(yǎng)元素的循環(huán)。微生物多樣性和豐度是表征微生物生態(tài)學特征的重要指標［2］。它極易受環(huán)境參數(shù)的影響，而森林中林型、海拔、土壤性質(zhì)、溫度和水分均是至關(guān)重要的影響因子［3-4］。植被可以通過改變土壤的營養(yǎng)物質(zhì)（有機碳和氮）含量、含水量、溫度、通氣性以及微環(huán)境pH等關(guān)鍵環(huán)境因子來間接影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度［5-6］。

目前，學者已展開植被與微生物群落相關(guān)的研究。如Ding等［7］對神農(nóng)架林線附近灌木林和針葉林土壤微生物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，灌木林土壤微生物群落多樣性均高于針葉林。在研究川西亞高山云杉人工林土壤微生物發(fā)現(xiàn)：林齡的增加使土壤微生物香農(nóng)多樣性指數(shù)和Pielou 均勻度指數(shù)均呈現(xiàn)先增后減的趨勢［8］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)不同植被土壤微生物的豐度存在顯著差異［9］?？梢娭脖徊町悓ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)和豐度有重要影響。

縉云山國家森林保護區(qū)位于重慶市北部，植物種類繁多，素有“川東小峨眉”之稱。目前該區(qū)域的研究多側(cè)重于土壤理化性質(zhì)［10-11］，少數(shù)涉及土壤微生物均采用單一分析技術(shù)或傳統(tǒng)培養(yǎng)方法來研究某種植被土壤微生物群落［9,12］，難以系統(tǒng)全面地了解該地區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度差異。結(jié)合該區(qū)域已有研究：表層土壤營養(yǎng)物質(zhì)豐富，但易受外界環(huán)境影響［10-11］。本文運用多種分子技術(shù)（末端限制性片段多態(tài)性分析，克隆文庫和熒光定量PCR技術(shù)）對該區(qū)域典型植被類型（常綠闊葉林、針葉林、毛竹林、針闊混交林）表層土壤細菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)和豐度進行定性和定量的分析，有益于了解土壤微生物與森林生產(chǎn)力及其發(fā)展演替的關(guān)系，為天然林的保護和可持續(xù)經(jīng)營提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

縉云山國家森林保護區(qū)位于重慶市北碚區(qū)境內(nèi)（106°17′43″—106°24′50″E，29°41′08″—29°52′03″N；面積7 600 hm2；平均海拔951.5 m；相對高差600 m），以下簡稱縉云山。屬典型的北亞熱帶溫暖濕潤季風氣候。年均氣溫13.6 ℃，年均降水量1 612 mm，年均日照1 294 h，年平均蒸發(fā)量777 mm?？N云山植被類型多樣，有高等植物244科、973屬、1 861種。土壤為三疊紀須家河砂巖發(fā)育的酸性黃壤（pH 4.0～4.5）。

1.2 研究方法

2016年5月下旬選取馬尾松針葉林 （簡稱針葉林，Coniferous forest）、殼斗科闊葉林（簡稱闊葉林，Broadleaved-leaved forest）、馬尾松針葉/殼斗科闊葉混交林（簡稱針闊混交林，Mixed broadleaf-conifer forest）以及毛竹林（P.pubescen forest）土壤為研究對象，每種植被類型選擇3個取樣點，在0～20 cm土層深度取樣，按四分法進行混勻，分別取1 kg 混后土樣，得到三等份樣品，用無菌PET樹脂袋封裝，放于冰盒中帶回實驗室。取50 g土樣于-20 ℃冰箱保存以備分子實驗分析，其余部分用于理化性質(zhì)分析。采樣點的詳細情況見表 1。

表1 采樣點基本概況Table 1 Outline of the sampling sites

理化分析土樣在室溫下自然風干，然后研磨過篩（2 mm、1 mm、0.25 mm），基本理化性質(zhì)采用文獻［13］的方法進行分析。土壤基本理化性質(zhì)見表2。

表2 土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of the soils at the sampling sites

1.3 土壤總DNA提取

利用Fast DNA spin kit for soil 試劑盒（MP BIO, Inc., Irvine, CA, USA）根據(jù)制造商提供的說明進行提取。洗脫后總DNA體積為50 μL。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳確認總DNA的提取質(zhì)量（電泳條帶的單一性），同時用NanoDrop ND-1000微光分光光度計（Thermo Fisher Scientific, USA）測定濃度。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量 PCR技術(shù)作為核酸定量檢測技術(shù)［14］，用基因拷貝數(shù)來表征某種微生物或功能微生物的豐度，具體步驟如下：

標準樣品的制作：選用熒光定量PCR引物擴增細菌16SrRNA（F357/R518）、古菌16SrRNA（U519/806R）和真菌ITS（NSI1/58A2R）區(qū)片段，對擴增產(chǎn)物進行純化（Universal DNA Purification Kit，TIANGEN）并克隆（見1.6）。將測序成功的陽性克隆子提取菌液質(zhì)粒DNA（TIANprep Mini Plasmid Kit，TIANGEN），并用NanoDrop ND-1000微光分光光度計、測定質(zhì)粒DNA濃度并計算拷貝數(shù)，以10倍為間隔系列稀釋成熒光定量PCR標準品。

樣品測定：將樣品與標準品同時進行qPCR檢測，包括陰性對照在內(nèi)每個樣品設(shè)3個重復(fù)。反應(yīng)體系為：ABI Prower SybrGreen qPCR Master Mix（ABI，USA）10 mL，細菌、真菌和古菌DNA模板分別為2、4和1 mL，引物各1、0.5和1 μL（10 pmol·μL-1），加ddH2O至終體積20 mL。每個循環(huán)中熒光收集在83 ℃下進行。熒光定量PCR分析由ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行。

1.5 末端限制性片段多態(tài)性分析

末端限制性片段多態(tài)性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism analysis，T-RFLP）［15］具體步驟如下：

基因片段的擴增：選用正向引物5′端帶熒光物質(zhì)FAM標記的引物擴增細菌16SrRNA(27F/1492R)、古菌 16S rRNA(Arch109F/Arch958R)和真菌ITS(ITS1F/ITS4)區(qū)片段。擴增體系為 50 mL，后擴增產(chǎn)物的純化和濃度測定同1.4。

產(chǎn)物酶切：采用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、HhaⅠ、RasⅠ（NEB，BioLabs）分別對細菌、真菌和古菌的純化DNA進行單酶切，根據(jù)制造商提供的說明進行酶切。隨后將酶切產(chǎn)物送至送生工生物工程有限公司(上海)進行毛細管電泳測序并輸出末端限制性片段（Terminal restrictions fragments, T-RFs）圖譜［16］。

1.6 克隆文庫

選用5′端不帶熒光物質(zhì)的引物對細菌16SrRNA、古菌 16S rRNA和真菌ITS（相關(guān)引物序列和體系見1.5）擴增。對擴增PCR產(chǎn)物進行純化（Universal DNA Purification Kit，TIANGEN），通過pGEM-T載體(Promega)進行克隆。根據(jù)“藍白斑”（抑制劑：X-Gal、Ampr和IPTG）對克隆子進行篩選。每個樣品各挑取15個陽性克隆子送至生工生物有限公司進行序列測定，每個樣本正確測序約10條。序列登錄號為：MG641100～MG641145；MG670412～MG670441；MG825386～MG825410；MH016246～MH016250。

1.7 數(shù)據(jù)分析

土壤理化性質(zhì)、微生物拷貝數(shù)的單因素方差分析和皮爾遜相關(guān)分析利用SPSS 21.0處理?；赥-RFLP數(shù)據(jù)，群落結(jié)構(gòu)α-多樣性指數(shù)分析，即豐富度指數(shù)（Richness，S）、均勻度指數(shù)（Evenness，J′）、香農(nóng)-威爾指數(shù)（Shannon-Weiner index，H′），利用Excel 2003完成；利用R語言的vegan 軟件包進行非度量多維尺度分析（Non-metric Multidimensional scaling，NMDS）和pheatmap軟件包進行熱圖（Heatmap）的繪制?；跍y序結(jié)果，利用Mothur軟件對序列進行可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）分析，通過Mega5.0 軟件對OTU進行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。利用CANOCO軟件對土壤環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)進行冗余分析(Redundancy Analysis, RDA)，并運用蒙特卡羅置換檢驗（Monte Carlo permutation test）去檢驗約束排序模型的顯著性（用F值作為統(tǒng)計量）。

2 結(jié) 果

2.1 不同森林植被土壤微生物的豐度

不同森林植被土壤微生物基因拷貝數(shù)，見圖1。細菌、古菌16S rRNA和真菌ITS基因拷貝數(shù)范圍分別為：3.04×105～4.47×108、1.46×106～1.53×107和6.44×104～1.90×106copies?μL-1。如圖可知，真菌ITS基因拷貝數(shù)最低；針葉林土壤微生物基因拷貝數(shù)最低。此外，由單因素方差分析可知：森林植被類型的變化對細菌和古菌影響顯著（P＜0.05）。皮爾遜相關(guān)分析顯示：細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與pH顯著正相關(guān)（r=0.607，P＜0.05）；古菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與含水量值顯著負相關(guān)（r=-0.919，P＜0.01）。

2.2 不同森林植被土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)

基于T-RFLP分析圖譜，利用多種а-多樣性特征值表征不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，見表3。同一種特征值中，真菌的數(shù)值均最高。針-闊混交林土壤中細菌的群落特征值顯著高于其他植被類型（P＜0.05）。此外，植被變化對古菌多樣性的影響最為顯著（P＜0.05）。

圖1 不同森林植被的土壤微生物拷貝數(shù)Fig.1 Copy number of the soil microbes relative to vegetation

表3 不同森林植被土壤微生物的群落特征值Table 3 Characteristics of the soil microbial community structure relative to vegetation

基于T-RFLP數(shù)據(jù)，NMDS 分析通過二維排序圖中樣點間距離表征不同植被類型土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。由圖2可知，微生物在不同森林植被土壤中的群落結(jié)構(gòu)的相似性各異。在細菌和古菌群落結(jié)構(gòu)中，針葉林的樣點距離最遠，即群落結(jié)構(gòu)最不相似。而真菌的群落結(jié)構(gòu)，針闊混交林和竹林的群落結(jié)構(gòu)最為相似。

熱圖分析能反映出不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析和各群落組成的相對豐度。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析結(jié)果與NMDS結(jié)果相同（圖3）。闊葉林的細菌種群組成最為復(fù)雜，其次為針葉林，而竹林最為單一。針闊混交林的真菌群落組分最為單一。各植被類型間古菌的種群組成差異不明顯。

不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析，見圖4。細菌群落結(jié)構(gòu)與pH、全磷和全鉀顯著相關(guān)（F分別為9.18、4.84和2.58，P＜0.05，蒙特卡羅算法）；真菌群落結(jié)構(gòu)與全鉀、有效磷和速效鉀顯著相關(guān)（F分別為2.28、2.15和5.83，P＜0.05，蒙特卡羅算法）。古菌群落結(jié)構(gòu)與全磷、速效鉀和全鉀顯著相關(guān)（F分別為2.56、1.20和1.35，P＜0.05，蒙特卡羅算法）。

2.3 不同森林植被土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育地位分析

圖2 不同森林植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的 NMDS 分析Fig.2 NMDS analysis of the soil microbial community structure relative to vegetation

不同森林植被土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育分析見圖5a-c。細菌有48個OTU；真菌有33個OTU；古菌有31個OTU；由圖5a可知：縉云山地區(qū)的細菌種類十分豐富，包括9個細菌門。針葉林中包含的細菌種類最單一，無優(yōu)勢種類。闊葉林和針-闊混交林土壤細菌的優(yōu)勢種群分別為：Chloroflexi（4/13）和Acidobacteria（7/15）。竹林土壤細菌的種類最為豐富，其中Gamma-proteobacteria（4/15）為優(yōu)勢種群，且Firmicute和Bacteroidetes為獨有種群。由圖5b可知，針闊混交林中真菌只有Ascomycota（7/7）。竹林和針葉林沒有明顯的優(yōu)勢種群。在闊葉林土壤中的優(yōu)勢種群為Zygomycota（8/10）。由圖5c可知，竹林中包括兩個古菌門，優(yōu)勢古菌為Thaumarchaeota（7/11）。針闊混交林的古菌中Thaumarchaeota（7/14）在三種菌中占優(yōu)勢。針葉林和闊葉林分別包括2種和3種古菌門，且均與其他植被下古菌的種類有明顯差別，尤其是針葉林，即它包括很大部分的未知古菌（5/10）。

圖3 不同森林植被土壤微生物群落組成相對豐度分析Fig.3 Relative abundant analysis of the soil microbial community structure relative to vegetation

圖4 不同森林植被土壤微生物群落的RDA排序圖Fig.4 RDA ordination analysis of the soil microbial community structure relative to vegetation

3 討 論

本文采用熒光定量PCR技術(shù)定量分析不同森林植被類型土壤微生物豐度的差異。本文中不同植被土壤的微生物豐度不存在絕對優(yōu)勢，在已有森林土壤微生物豐度的研究中也得到相同結(jié)論［17-19］。Siles和Margesin［17］研究發(fā)現(xiàn)，高原森林土壤中細菌的拷貝數(shù)最高，真菌次之，古菌最低。而此結(jié)果與本文中細菌最高，古菌次之，真菌最低的結(jié)果相悖。這可能是由于微生物群落對環(huán)境條件(如水、氣、熱等生態(tài)因子) 的偏好性以及不同氣候區(qū)、不同森林類型下土壤性質(zhì)的差異［20-21］。本研究中，針葉林各微生物豐度明顯低于其他植被類型，這與傳統(tǒng)微生物學方法研究縉云山不同林分下微生物的豐度結(jié)果類似［9］。微生物豐度與土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)性研究眾多，Bardelli等［18］研究發(fā)現(xiàn)細菌的拷貝數(shù)受到pH的影響，而真菌幾乎不受環(huán)境影響，以上結(jié)果與本文相同；但古菌的拷貝數(shù)與pH和C/N含量顯著有關(guān)，與本文相異。但已有研究給出合理解釋：縉云山地區(qū)是季風氣候，季節(jié)性降水直接影響土壤中的pH和C/N［11］，所以古菌受水分含量顯著影響也是可信的。

T-RFLP技術(shù)研究不同森林植被土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。本文研究顯示：真菌的群落結(jié)構(gòu)最豐富，且香農(nóng)-威爾多樣性指數(shù)顯示古菌多樣性受植被影響最顯著，該結(jié)果與已有研究存在差異［22］。一方面是因為高濃度氫離子抑制細菌生長［23］。本實驗土壤偏酸性，這就解釋了為何真菌群落結(jié)構(gòu)略高于細菌。另一方面，植被品種有直接影響。如Lynch等［24］研究不同樹種下微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：雖然木黃麻和桉樹均為喬木，但桉樹分泌的有毒的酚醛樹脂和萜烯使其土壤中微生物群落更易受影響。本文中闊葉林的細菌群落結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，這與柳春林等［25］結(jié)果相似。不同森林植被土壤中細菌、真菌和古菌均表現(xiàn)出差異，但程度不同與前人研究相同［18,22,26］。

系統(tǒng)發(fā)育分析得出不同森林植被優(yōu)勢土壤微生物種群。本文闊葉林土壤微生物的優(yōu)勢種群（Chloroflexi、Zygomycota）與已有研究不一致，但已有研究也沒有確定的結(jié)論［22,27-28］。這直接表現(xiàn)出闊葉林植物品種對微生物的影響［24］。本文中針闊混交混林和竹林中優(yōu)勢種群（Acidobacteria、Gamma-proteobacteria；Ascomycota；Thaumarchaeota）與前人所得結(jié)果完全相異［16,22］，間接地表現(xiàn)出縉云山地區(qū)的針闊混交林和竹林的微生物群落有明顯的特異性。文中T-RFLP和克隆技術(shù)在體現(xiàn)細菌群落組成上有一定程度的差異，主要是T-RFLP分析中自動排除了一些豐度較低的細菌種群，而克隆在挑取克隆子時可控性小，可能挑取到豐度低的種群。所以兩種分子技術(shù)綜合應(yīng)用能幫助我們得到更可信的結(jié)果。

CANOCO軟件中RDA分析可研究環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響［8,26,29］。微生物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子多為pH、全氮和有機碳［8,26,29］，因為有機碳是微生物的主要能源物質(zhì)［30］，而氮的有效性常抑制微生物的生長活性［31］。但本研究中影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子除pH外還有鉀、磷元素。首先，相對于有機碳和氮因素，鉀、磷元素的限制掩蓋了它們的作用。其次，縉云山森林地區(qū)受亞熱帶季風影響，雨水眾多易造成土壤中鹽基離子（K+）被淋洗，使土壤pH 濃度普遍偏低［11］。而酸性環(huán)境會使P生成難溶性物質(zhì)不能被微生物利用［32］。以上均可能是造成K、P元素成為抑制微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)展的原因。

4 結(jié) 論

本研究利用多種分子技術(shù)得出縉云山國家森林保護區(qū)內(nèi)4種植被類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化規(guī)律。針葉林土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)最為獨特，但豐度最低。真菌的多樣性最高，但豐度優(yōu)勢不明顯。在眾多森林土壤環(huán)境理化性質(zhì)中，除了pH， K、P元素同樣是制約微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)展的主要環(huán)境因子。不同植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度均存在明顯地差異，這種差異與林型、土壤環(huán)境存在密切的關(guān)系，在一定程度上反映了各植被土壤有機質(zhì)轉(zhuǎn)化狀況、土壤肥力水平和穩(wěn)定性。對天然林的保護和持續(xù)經(jīng)營有一定理論與實際意義。