秈稻背景下抑制不同ALK等位基因表達對稻米品質的影響

陳專專 李先鋒 仲敏 葛家奇 范曉磊, 2 張昌泉, 2 劉巧泉, 2, *

秈稻背景下抑制不同等位基因表達對稻米品質的影響

陳專專1, 2, #李先鋒1, #仲敏1葛家奇1范曉磊1, 2張昌泉1, 2劉巧泉1, 2, *

(1揚州大學 農(nóng)學院 植物功能基因組學教育部重點實驗室/江蘇省作物基因組學和分子育種重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2揚州大學 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人, E-mail: qqliu@yzu.edu.cn)

稻米糊化溫度是影響稻米品質的重要指標，該性狀受主效基因/調控，基因具有多個復等位基因，本研究旨在通過RNAi技術明確秈稻亞種中兩個不同等位基因的效應。以分別含有ALK和ALK等位基因的高糊化溫度品種珍汕97B和低糊化溫度品種龍?zhí)馗為試驗材料，使用RNAi技術構建表達下調的轉基因株系，通過對其稻米理化品質的測定來明確不同等位基因表達下調對稻米品質的影響。對不同轉基因水稻目的基因的表達分析顯示本研究中轉基因株系的基因受到了不同程度的干擾。重點分析了不同RNAi株系稻米的糊化溫度，結果表明珍汕97B的RNAi轉基因稻米的糊化溫度極顯著降低，而在低糊化溫度品種龍?zhí)馗背景中下調表達基因后對糊化溫度的影響較小；轉基因株系與未轉化親本相比，米粉的起始糊化溫度都顯著降低，表現(xiàn)為提前糊化；在珍汕97B背景下干擾系的峰值溫度與未轉化親本相比極顯著降低，而在龍?zhí)馗Ρ尘跋旅追鄣姆逯禍囟扰c未轉化對照相比顯著降低。對不同轉基因系的理化品質分析表明，下調表達植株稻米的表觀直鏈淀粉含量顯著增加，下調表達后會引起米粉峰值黏度和崩解值的改變。高糊化溫度品種珍汕97B干擾系與未轉化對照相比膠稠度呈現(xiàn)極顯著性差異，而低糊化溫度品種龍?zhí)馗Ω蓴_系的膠稠度與未轉化對照相比沒有差異。下調表達等位基因對稻米理化品質產(chǎn)生顯著影響，并且干擾不同等位基因的效應存在明顯差異，即秈稻中的兩個等位基因的效應存在顯著差異。

水稻；等位基因；RNA干擾；糊化溫度；稻米品質

水稻是世界上近一半人口的主食。隨著人們生活水平的不斷提高和水稻單產(chǎn)的不斷增加，優(yōu)質稻米已經(jīng)成為引導消費和品種改良的首要目標[1-4]，其中稻米的蒸煮食味品質是當前品質改良育種的關鍵，一般通過稻米的理化特性包括直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度以及淀粉黏滯性等指標對蒸煮食味品質進行綜合評價。

糊化溫度作為評價稻米蒸煮食味品質的主要指標，是指大約90%淀粉顆粒吸熱膨脹，自然的晶體結構被破壞和雙折射性喪失，發(fā)生非均質改變的不可逆過程時所需要的臨界溫度[4]。根據(jù)糊化溫度的不同，可將稻米分為高、中、低糊化類型。其中，中等以及較低糊化溫度的稻米蒸煮后米飯質地較軟且食味特性較好，在市場上廣受消費者歡迎。迄今為止，稻米糊化溫度的形成在遺傳和受環(huán)境影響方面已有廣泛研究[3, 5, 6]。盡管稻米糊化溫度是一個在較大范圍內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)變化的數(shù)量性狀，但其主要由基因編碼的可溶性淀粉合成酶SSⅡ-3控制[7-11]?；蛟谠耘嗟局写嬖诙喾N等位變異類型，是導致不同水稻品種之間糊化溫度差異，進而影響稻米蒸煮食味品質的主要原因[12]?；虻亩ㄎ缓涂寺∽钤缬筛哒裼畹萚8]完成，前人通過分析不同水稻品種間基因的序列差異，證明了基因序列差異引起的氨基酸改變會引起SSⅡ-3酶活性改變，從而影響支鏈淀粉的中等長度分支鏈的合成，使晶體層結構改變，最終表現(xiàn)為糊化溫度的差異[8, 13-14]。

多個研究顯示，位于基因第8外顯子的3個單核苷酸差異(SNP)對功能和淀粉的糊化特性至關重要[15-18]。根據(jù)這3個SNP，可將栽培品種中的基因分為A-GC，G-TT和G-GC三種單倍型。其中的G-GC型等位基因(簡稱為ALK)控制稻米的高糊化溫度，A-GC(簡稱為ALK)和 G-TT(簡稱為ALK)控制低糊化溫度。由于ALK(A-GC)主要存在于粳稻中[18-21]，而ALK(G-TT)和ALK(G-GC)主要存在于秈稻中。因此，本研究選取了秈稻背景下低糊化溫度的龍?zhí)馗(攜ALK基因)和高糊化溫度的品種珍汕97B(攜ALK基因)為受體品種，利用RNAi技術下調表達等位基因，以明確下調表達秈稻中兩個等位基因對稻米品質的影響。

1 材料與方法

1.1 水稻材料和種植方法

用于本研究的兩個秈稻品種(L. subsp.)為龍?zhí)馗和珍汕97B。兩個秈稻品種分別含有不同的等位基因，稻米的糊化特性差異較大，含有ALK(G-TT)的龍?zhí)馗Γ聦秃瘻囟?，含?i>ALK(G-GC)的珍汕97B對應高糊化溫度。兩個受體品種龍?zhí)馗Γ潞驼渖?7B稻米分別為低糊化溫度和高糊化溫度品種，兩者的等位基因類型可通過引物4342(GC/TT)區(qū)分。如圖1A，兩個品種中的基因型不同，龍?zhí)馗中表現(xiàn)為G-TT的ALK型，而珍汕97B中表現(xiàn)為G-GC的ALK型。所用水稻材料在揚州大學農(nóng)學院作物遺傳育種實驗田或海南三亞育種基地種植(加代)，按常規(guī)方法進行栽培管理。用于品質測定的材料均種植于江蘇省揚州大學農(nóng)學院作物遺傳育種實驗田。

1.2 載體構建與水稻轉化

以來自日本晴 RNA所合成的第一鏈cDNA為模板，以ALK-5和ALK-3為引物(表1)擴增基因編碼區(qū)片段；將PCR擴增片段連入含有H Ⅰ/Ⅰ和H Ⅰ/Ⅰ雙酶切位點的p1022載體中，形成同時含有正向和反向基因片段的結構。將整個含有正反向重復的片段連入含有水稻谷蛋白基因Gt1啟動子(胚乳特異性表達)的p3002載體中，構建-RNAi載體(圖1-B)。

利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方式[22]將以上載體導入秈稻品種龍?zhí)馗中，獲得L-ALK- RNAi轉基因材料，選取3個轉基因純合系L-ALK-RNAi-1、-2和-3用于后續(xù)品質分析。以L-ALK-RNAi-2轉基因材料為供體，與珍汕97B雜交，后自交。通過分子標記輔助選擇篩選雜交后代，在F3代獲得同時攜帶有ALK等位基因和ALK-RNAi干擾結構的轉基因材料，選取3個純合轉基因系Z-ALK-RNAi-2-1、Z-ALK-RNAi-2-2和Z-ALK-RNAi-2-3用于后續(xù)的品質分析。

表1 本研究所用的PCR引物

1.3 基因型鑒定

水稻基因組DNA抽提按Murray等[23]的方法進行。等位變異位點用四引物4342進行基因型鑒定，RNAi株系的基因型用引物INT-F和NOS-R進行PCR驗證，所有引物序列列于表1。

1.4 ALK基因的表達量分析

利用總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取水稻花后15 d種子胚乳中的總RNA并純化定量，每個樣品取3 μg預處理后的RNA，用含有去除基因組DNA進行實時熒光定量PCR的專用反轉錄試劑盒(Prime script RT reagent kit with gDNA Eraser，TaKaRa)除去RNA樣品中的基因組DNA后對RNA樣品進行反轉錄，獲得第一鏈cDNA。隨后用實時熒光定量PCR的專用試劑盒(TaKaRa)和實時熒光定量PCR儀(CFX96 Touch Real-time PCR detection system, Bio-Rad)進行實時定量PCR分析?；虻谋磉_量分析所用引物為ALK-RT-F和ALK-RT-R(表1)。

1.5 稻米理化品質測定

米粉的制備以及直鏈淀粉含量、膠稠度、堿消值等指標的測定采用農(nóng)業(yè)部頒布的標準《米質測定方法》(NY147?1988)。米粉熱力學特性參照Zhang等[24]的方法測定，用帶有配套分析軟件的差示掃描量熱儀DSC 200 F3(德國耐馳公司)進行作圖分析。淀粉的黏滯性采用3-D型淀粉黏滯性快速測定儀(Newport Scientific，澳大利亞)進行測定，配套分析軟件為TCW(Thermal Cycle for Windows)。粗蛋白含量利用凱氏定氮法測定。

1.6 精米食味值的測定

采用RCTA-11A米飯食味計(日本佐竹)測定食味值，稱取整精米20.0 g，使用配套的淘米用具在清水下清洗，清洗完畢轉移至含有40 mL 蒸餾水的鋁制容器中，用電飯鍋蒸煮30 min后室溫冷卻平衡20 min，稱取8.0 g冷卻好的米飯，裝入金屬環(huán)內(nèi)，正反方向各壓10 s，置于食味儀上測得食味值。

1.7 淀粉鏈長分布的測定

采用高效陰離子交換色譜法測定支鏈淀粉的鏈長分布，樣品制備參考Zhu等[25]的方法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016以及SPSS 19.0 軟件進行方差分析；采用Adobe Illustrator制圖；新復極差法進行多重比較檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 轉基因水稻植株的獲得及其表達分析

通過分子標記輔助選擇篩選雜交后代，在F3代獲得同時攜帶有ALK等位基因和RNAi干擾結構的三份轉基因株系Z-ALK-RNAi-2-1、Z-ALK- RNAi-2-2和Z-ALK-RNAi-2-3，其生育期與珍汕97B基本一致。以RNAi載體中的引物INT-F和NOS-R(引物位置如圖1-B)對RNAi干擾株系進行PCR擴增，所有轉基因水稻植株中都能擴增出大小為534 bp的目的片段(圖1-C)。

由于基因主要在水稻胚乳中表達，為驗證RNAi株系中對表達的干擾效果，我們利用熒光實時RT-PCR技術對花后15 d胚乳中基因的表達量進行分析(圖1-D)。不論是高糊化溫度品種珍汕97B背景還是低糊化溫度品種龍?zhí)馗Ρ尘埃?RNAi轉基因材料的表達量都大幅度下降，表明RNA干擾結構確實導入水稻體內(nèi)并發(fā)揮了作用。

2.2 ALK-RNAi轉基因稻米的熱力學特性

干擾基因表達后，與各自未轉化親本相比，堿消值顯著上升，糊化溫度明顯下降(圖2)。結合表2來看，在含有ALK等位基因的龍?zhí)馗背景下，干擾株系稻米糊化溫度T變化較小，僅下降了0.7℃~1.1℃；在含有ALK等位基因的珍汕97B背景下，干擾株系稻米糊化溫度變化較大，相比親本極顯著下降了5.8℃~6.8℃。各干擾材料的起始糊化溫度和終止糊化溫度也呈現(xiàn)出相同的規(guī)律，表現(xiàn)為高糊化溫度品種珍汕97B中干擾等位基因對糊化溫度的效應較強，而低糊化溫度品種龍?zhí)馗χ懈蓴_等位基因對糊化溫度的效應較弱。

A?用引物4342(GC/TT)鑒定親本對照龍?zhí)馗(LTFB)和珍汕97B(ZS97B)的ALK基因型。B?含ALK-RNAi 結構雙元載體的T-DNA區(qū)結構。P35S和Tnos, 分別表示CaMV35S基因的啟動子和終止子區(qū); NOS?農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子; Hyg?潮霉素抗性基因; LB和RB分別表示T-DNA區(qū)的左右邊界序列; Anti和Sense分別表示目的基因片段的反向和正向結構;圖中箭頭表示設計引物方向。C?ALK-RNAi轉基因水稻植株的PCR鑒定。D?ALK-RNAi轉基因水稻植株胚乳中ALK基因表達量分析。L-ALKb-RNAi-1、L-ALKb-RNAi-2和L-ALKb-RNAi-3為龍?zhí)馗Ρ尘跋碌腁LKb-RNAi轉基因純合系；Z-ALKc-RNAi-2-1、Z-ALKc-RNAi-2-2和Z-ALKc-RNAi-2-3為同時攜帶有ALKc等位基因和ALKb-RNAi干擾結構的轉基因材料純合系。對不同背景下的轉基因系和未轉化對照的表達量進行方差分析，并用新復極差法進行多重比較。**表示轉基因系與未轉化對照之間的差異達0.01顯著水平，*表示轉基因系與未轉化對照之間的差異達0.05顯著水平(n=3)。

Fig. 1.-RNAi construction and idendification of transgenic rice.

2.3 RNAi轉基因系稻米的表觀直鏈淀粉含量和膠稠度

下調表達基因后，轉基因株系米粉的表觀直鏈淀粉含量都有所上升，其中高糊化溫度品種珍汕97B干擾系的表觀直鏈淀粉含量與未轉化對照相比上升了1.5~2.7個百分點(表2)，呈現(xiàn)極顯著差異，而低糊化溫度品種龍?zhí)馗Ω蓴_系的表觀直鏈淀粉含量與未轉化對照相比沒有顯著差異。在兩個不同糊化溫度品種中下調表達后，膠稠度數(shù)值都有所下降，米膠變硬。低糊化溫度的龍?zhí)馗Ρ尘跋赂蓴_系的膠稠度與未轉化對照無顯著差異；相反，高糊化溫度的珍汕97B品種干擾系的膠稠度與未轉化對照相比存在極顯著差異，相較于未轉化對照下降幅度為13~33 mm?？梢钥闯?，通過RNAi下調表達基因對高糊化溫度品種珍汕97B米粉的理化性質影響較大，導致相應的轉基因株系膠稠度數(shù)值極顯著下降。

2.4 ALK-RNAi轉基因系稻米的RVA譜分析

本研究用黏度速測儀測定了龍?zhí)馗和珍汕97B及其RNA干擾系米粉的黏滯性(圖3-A)。結合表3可以看出，從峰值黏度、熱漿黏度和崩解值來看，龍?zhí)馗和珍汕97B的干擾系與各自親本相比都明顯升高，高糊化溫度品種珍汕97B干擾后表現(xiàn)出更高的峰值黏度、熱漿黏度和崩解值；就消減值而言，龍?zhí)馗背景僅僅下降了184~441 cP，而在珍汕97B背景下，相較于未轉化對照下降了948~1429 cP。起漿溫度也呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律，低糊化溫度品種龍?zhí)馗Φ母蓴_系相較于未轉化對照只下降了0.1℃~1.0℃，而高糊化溫度品種珍汕97B的干擾系則下降了11.2℃~12.1℃，這與糊化溫度的數(shù)據(jù)規(guī)律相一致。

表2 ALK-RNAi轉基因水稻株系米粉的熱力學特性和理化特性

平均值±標準差(=2)。**表示轉基因系與未轉化對照差異極顯著(<0.01)，*表示轉基因系與未轉化對照差異顯著(0.01≤0.05)。下表同。

Data are shown as mean±SD(=2). Double asterisks denote a highly significant difference between transgenic line and its wild type at<0.01, single asterisk denotes a significant difference between transgenic line and its wild type at 0.01≤<0.05. The same as below.

A?ALK-RNAi水稻株系精米在1.7% KOH中的堿消值; B?ALK-RNAi 水稻株系米粉的DSC曲線。

Fig 2. Gelatinization properties of-RNAi transgenic rice.

2.5 RNAi轉基因稻米的食味值

為進一步確認-RNAi對稻米食味品質的影響，我們測定了轉基因株系稻米的食味值，結果如表4所示。在水稻中干擾基因后，稻米的食味值會出現(xiàn)顯著甚至極顯著下降。在龍?zhí)馗Ρ尘跋?i>ALK干擾株系熱米飯的食味值降幅較小，為2.2~5.0，珍汕97B背景下ALK干擾株系熱米飯的食味值降幅較大，為9.5~13.0。食味值的變化與糊化溫度的變化規(guī)律一致，食味值的下降主要由于下調表達后引起了直鏈淀粉含量的增加和膠稠度的下降而使得稻米的外觀和口感變差，最終導致食味值的綜合評分降低。

2.6 RNAi轉基因稻米的淀粉精細結構

前人研究表明，等位變異會引起支鏈淀粉結構短鏈(DP<11)的增加以及中短鏈(DP 12?24)含量的減少，進而導致稻米糊化溫度降低[7, 26, 27]。因此，我們利用HPAEC技術分析了水稻干擾株系中支鏈淀粉的鏈長分布情況。如圖3-B所示，干擾等位基因會改變支鏈淀粉結構，淀粉中的短鏈含量受基因干擾的影響較大。在兩個不同糊化溫度品種中干擾等位基因后，淀粉鏈長分布變化曲線差異較大。低糊化溫度品種干擾株系的支鏈淀粉結構與未轉化對照相比，DP 6?8和DP 13?30的中長鏈淀粉含量增加，DP 9?12含量減少；高糊化溫度品種干擾株系的支鏈淀粉結構與未轉化對照相比DP 6?11和DP 25?36的中長鏈淀粉含量增加，DP 12?24含量減少(圖3-B)。這些結果可以很好地解釋干擾基因引起的糊化溫度的變化，因為DP<10支鏈淀粉的減少可以提高糊化溫度[26, 28]。同時也能從一定程度上解釋不同等位基因之間的差異，ALK-RNAi株系的糊化溫度的大幅降低是由于短鏈的DP 6?11顯著增加以及DP 25?36的顯著減少導致的。

表3 ALK-RNAi轉基因水稻株系米粉的RVA譜特征值