谷氧還蛋白(AbGrx-1)對水稻干尖線蟲在氧化脅迫下的保護(hù)作用

馮輝 范亞磊 張金鳳 朱紅利 魏利輝, , *

谷氧還蛋白(AbGrx-1)對水稻干尖線蟲在氧化脅迫下的保護(hù)作用

馮輝2范亞磊2張金鳳2朱紅利1魏利輝1, 2, *

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，南京 210014；*通訊聯(lián)系人，E-mail：weilihui@jaas.ac.cn)

谷氧還蛋白(glutaredoxin, Grx)作為一種抗氧化酶，在通過清除多余活性氧來維持生物細(xì)胞氧化還原平衡、降低細(xì)胞膜損傷過程中發(fā)揮重要作用。水稻干尖線蟲()能在高溫、滲透及氧化脅迫等多種逆境壓力中存活。本研究旨在探究Grx在水稻干尖線蟲抗氧化脅迫中的作用。通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，獲得了一個水稻干尖線蟲谷氧還蛋白基因，進(jìn)行了序列比對和遺傳進(jìn)化分析；通過qRT-PCR檢測了在線蟲響應(yīng)氧化和溫度脅迫中的表達(dá)差異，通過原核表達(dá)獲得了AbGrx-1的重組蛋白，并分析了AbGrx-1蛋白浸泡對水稻干尖線蟲在氧化和高溫脅迫下存活的影響?；蛉L包括90 bp的5＇非翻譯區(qū)(UTR)、321 bp的編碼區(qū)和97 bp的3＇UTR，開發(fā)閱讀框(橫跨91至411位)編碼106個氨基酸。AbGrx-1蛋白的第24至27位點(diǎn)具有谷氧還蛋白催化殘基(CPYC)，分別在第69至第72和第83至第86位點(diǎn)存在保守的谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)RSVP和GGDD，歸為Ⅰ類谷氧還蛋白。遺傳進(jìn)化樹顯示AbGrx-1與燕麥真滑刃線蟲()Grx親緣關(guān)系最近，位于同一進(jìn)化分支。在H2O2處理和12℃下時顯著上調(diào)表達(dá)，但在0℃, 4℃, 37℃和45℃極端溫度中下調(diào)表達(dá)。高濃度H2O2和高溫導(dǎo)致水稻干尖線蟲死亡率增加，AbGrx-1重組蛋白能顯著提高暴露于高濃度H2O2中線蟲的存活率，但不影響高溫下線蟲的存活率。AbGrx-1參與調(diào)控水稻干尖線蟲的抗氧化免疫反應(yīng)，在抵抗氧化損傷、維持線蟲生存方面具有重要功能。

水稻干尖線蟲；谷氧還蛋白；基因克??；重組蛋白；抗氧化

活性氧(ROS)是生物體在呼吸、代謝時因氧分子的不完全還原而產(chǎn)生的，在需氧生物發(fā)育過程中十分重要。除此之外，生物體還會受到外界氧化脅迫壓力導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。ROS的過度積累會損傷生物大分子DNA、蛋白質(zhì)和脂類[1]。為了避免氧化損傷，生物體利用酶和非酶抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)自身氧化平衡。谷氧還蛋白(Grx)是維持胞間氧化平衡的關(guān)鍵酶，利用谷胱甘肽的還原能力維持和調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和氧化還原信號途徑，在胞內(nèi)ROS清除、蛋白和脂類氧化損傷修復(fù)等抗氧化過程中發(fā)揮重要功能[2, 3]。

Grx是熱穩(wěn)定和小分子量(10~16 kD)蛋白，具有3個活性結(jié)構(gòu)域，即二硫鍵活性中心、GSH結(jié)合位點(diǎn)和一個疏水性表面區(qū)域。Grx 活性中心的氨基酸序列為-Cys-Pro-Tyr-Cys-，其中，半胱氨酸(Cys)為催化基團(tuán)。根據(jù)序列特點(diǎn)，Grx可分為六類(Ⅰ-Ⅵ)，其中，二硫基(Ⅰ類)和單硫基(Ⅰ或Ⅱ類)在所有生物中均存在，Ⅲ類在高等植物中存在，Ⅳ類在光合作用的真核生物中存在，Ⅴ類存在于藍(lán)藻細(xì)菌和變形菌中，Ⅵ類存在于藍(lán)藻細(xì)菌中[1]。

目前僅有少數(shù)幾個種類線蟲的基因被克隆和研究，這些在維持線蟲細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)、降低細(xì)胞膜損傷發(fā)揮重要作用。模式生物秀麗隱桿線蟲()谷氧還蛋白GLRX-21能阻止硒誘導(dǎo)的氧化脅迫對線蟲的損害[4]。動物寄生線蟲克氏錐蟲()谷氧還蛋白TcGrx參與二硫谷胱甘肽還原反應(yīng)以及靶標(biāo)蛋白的去谷胱甘肽化[5]。草莓芽線蟲()的谷氧還蛋白AF-GLX-1受脫水干燥和滲透壓脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并參與調(diào)控線蟲在逆境下越冬和存活[6]。

水稻干尖線蟲()是水稻上的遷移性寄生線蟲，在進(jìn)入水稻穎花后迅速繁殖，在25℃最適溫度下10 d就可繁殖一代，并伴隨著水稻的成熟逐漸進(jìn)入低濕休眠狀態(tài)[7]?；谶@種特性，水稻干尖線蟲具有忍受脫水干燥的能力，在干燥種子中能進(jìn)入休眠狀態(tài)，兩三年內(nèi)仍保持很強(qiáng)的活力。水稻干尖線蟲還有抵抗溫度逆境的能力。Tenent等[8]發(fā)現(xiàn)水稻干尖線蟲在貯存于?18℃的稻種中可存活30個月；同時，由于水稻干尖線蟲侵染水稻地上組織，在水稻生長季節(jié)的大田環(huán)境中，常常暴露于高溫環(huán)境中，因此水稻干尖線蟲也具有極強(qiáng)的耐高溫能力。此外，之前的一些研究利用氧化劑(H2O2)對水稻干尖線蟲進(jìn)行表面消毒而不影響線蟲的運(yùn)動和侵染，暗示水稻干尖線蟲具有強(qiáng)大的抵抗氧化脅迫能力。目前參與水稻干尖線蟲的抗逆反應(yīng)多個基因被克隆，包括鈣網(wǎng)膜蛋白[9]、熱激蛋白HSP90[10]、海藻糖酶[11]和胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因等[12]。這些基因在水稻干尖線蟲應(yīng)對溫度脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫以及取食等過程中發(fā)揮作用，但有關(guān)Grx的功能仍未見報(bào)道。

本研究克隆了一個水稻干尖線蟲抗谷氧還蛋白基因，并對其在線蟲響應(yīng)氧化和溫度脅迫過程中的表達(dá)情況進(jìn)行了監(jiān)測，同時對進(jìn)行了原核表達(dá)，分析了AbGrx-1重組蛋白對氧化脅迫和高溫脅迫下線蟲存活的影響，以期闡明水稻干尖線蟲的逆境適應(yīng)機(jī)理，為防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲準(zhǔn)備

線蟲最初分離自水稻病穗，后在長滿灰葡萄孢菌 ()的平板上培養(yǎng)擴(kuò)繁。將在平板上培養(yǎng)20 d左右的線蟲用無菌水洗滌下來，用35%蔗糖溶液進(jìn)行收集純化，并用消毒液(含100 μg/mL 兩性霉素B、100 μg/mL 硫酸鏈霉素和100 μg/mL氨芐青霉素)洗滌蟲體3次，最后用ddH2O洗滌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和cDNA合成

收集50 μL 活性良好的線蟲在液氮中速凍30s，然后用一次性研磨棒迅速研磨成勻漿，采用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)進(jìn)行RNA提取。RNA質(zhì)量和產(chǎn)量通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計(jì)(OD260/280)進(jìn)行評估。

cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiscriptII 1stStrand cDNA Synthesis Kit, 南京)說明書進(jìn)行：將含有1 μL RNA(1 μg/μL)，1 μL Oligo dT23引物(10 μmol/L)和6μL ddH2O的無核酸酶的PCR管，于65℃下孵育5 min，立即冰上放置2 min，然后向PCR管中加入10 μL 2×RT Mix和2 μL 反轉(zhuǎn)錄酶(HiscriptII Enzyme)，混勻后50℃下孵育45 min，最后在85℃下孵育5min。

1.3 基因克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的多種線蟲保守序列信息，應(yīng)用CODEHOP程序(http://blocks.fhcrc.org /codehop.html)設(shè)計(jì)簡并引物degGrx-F/R，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。根據(jù)獲得的部分序列信息應(yīng)用Primer 3軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)特異引物。

3＇和5＇端序列根據(jù)cDNA末端快速擴(kuò)增試劑盒(SMART? RACE cDNA Ampli?cation Kit，Clontech, 美國)進(jìn)行擴(kuò)增。對于3＇端，25 μL反應(yīng)體系如下：2.5 μL 10×PCR緩沖液，2 μL MgCl2(25 mmol/L)，2 μL dNTP (10 mmol/L)，引物AbGrx-F1和UPM (10 μmol/L)各2 μL，0.25 μg cDNA 模板和1個單位的Ex聚合酶(TaKaRa,大連)。PCR條件如下：95℃下預(yù)變性5 min；95℃下變性30 s，62℃下退火30 s，72℃下延伸2.5 min，38個循環(huán)；最后72℃下延伸10 min。5＇端采用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪采用引物AbGrx-R1和UPM進(jìn)行降落PCR，體系和條件參照試劑盒說明。第二輪采用引物AbGrx-R2和NUP，反應(yīng)模板為稀釋50倍的第一輪PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件同3＇端RACE。完整序列采用包含開放閱讀框的引物AbGrx-fullF和AbGrx-fullR進(jìn)行擴(kuò)增，除退火溫度變?yōu)?5℃，其余反應(yīng)條件同前。所用引物見表1。

表1 本研究引物列表

下劃線為限制性內(nèi)切酶I/I的酶切位點(diǎn)。

The underlined refer to the digestion site byl/l.

1.4 序列和遺傳分析

水稻干尖線蟲谷氧還蛋白(AbGrx-1)氨基酸序列、等電點(diǎn)pI及分子量通過Lasergene 7.1進(jìn)行預(yù)測。AbGrx-1基序特征通過保守域數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進(jìn)行分析。蛋白信號肽、跨膜特征和亞細(xì)胞定位分別用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)、TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM-2.0/)和SubLoc1.0 (http://www. bioinfo.Tsinghua.edu.cn/Sub Loc/)進(jìn)行預(yù)測。采用Clustal O 1.2.4(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clus talo/)進(jìn)行序列比對分析，并用BoxShade 3.21 (http:// ch. embnet.org/software/BOX_ form.html)進(jìn)行圖像修飾。應(yīng)用MEGA 7構(gòu)建臨近樹(Neighbor-joint)，采用步靴值(Bootstrap)進(jìn)行計(jì)算，重復(fù)1000次。

1.5 線蟲氧化脅迫和溫度逆境存活監(jiān)測

為監(jiān)測在不同程度氧化脅迫和溫度逆境下水稻干尖線蟲的存活率，設(shè)置以下實(shí)驗(yàn)：對于氧化脅迫，將約100 條活性良好的線蟲分別浸泡于含有0、5、10、25、50、100和250 mmol/L H2O2溶液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，室溫靜置48 h，每12 h在體式顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲存活率；對于溫度脅迫，將每孔含有約100條線蟲水懸液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別置于0℃、4℃、12℃、25℃、37℃和45℃孵育箱中，每12 h統(tǒng)計(jì)線蟲的存活率。每個處理重復(fù)6次。

1.6 基因差異表達(dá)分析

基于氧化脅迫和溫度逆境存活結(jié)果，在處理12 h后分別收集不同濃度H2O2和溫度脅迫條件下的線蟲，并進(jìn)行RNA提取。利用TRIzol試劑提取線蟲總RNA，過程同前。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，TaKaRa, 大連]進(jìn)行cDNA合成；采用熒光定量試劑盒(SsoFast EvaGreen Supermix，Bio-Rad, 美國)進(jìn)行定量PCR(qRT-PCR),并通過Bio-Rad IQ5系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。以水稻干尖線蟲 18S rDNA 為內(nèi)參基因，利用特異引物Ab-18S-F和Ab-18S-R進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄豐度檢測。共3次生物學(xué)重復(fù)。相對表達(dá)水平用2?ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算[14]，并采用檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異顯著性。

1.7 AbGrx-1蛋白原核表達(dá)和純化

利用分別含有I和I酶切位點(diǎn)引物AbGrx-28a和AbGrx-28a擴(kuò)增AbGrx1編碼區(qū)序列，連接到pET28a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，測序正確轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，并將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，提取陽性克隆進(jìn)行蛋白表達(dá)，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。融合菌株在15℃下誘導(dǎo)15 h后進(jìn)行超聲破碎，含有重組蛋白的上清用6×His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(ProbeGene, 徐州)進(jìn)行洗脫純化。洗脫的蛋白在20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中透析濃縮，并通過BCA試劑盒(ProbeGene, 徐州)測定蛋白濃度。

5＇和3＇非翻譯區(qū)用小寫字母表示，開放閱讀框用大寫字母表示；谷氧還蛋白催化殘基用方框表示；用于擴(kuò)增全長序列的基因特異引物用下劃線標(biāo)注；終止子（TAA）用星號表示。

Fig. 1. Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of the AbGrx-1 cDNA (GenBank Accession No. KP190142).

1.8 AbGrx-1蛋白溶液對逆境脅迫下的線蟲存活的影響

為檢測純化蛋白是否影響線蟲的存活，將線蟲置于含有不同濃度(0、5、10、25和50 μmol/L)的AbGrx-1蛋白溶液中，室溫浸泡48 h，每12 h觀察線蟲存活率。為明確AbGrx-1能否增強(qiáng)線蟲對氧化脅迫和高溫脅迫的能力，將約100條線蟲加入終濃度為5 μmol/L AbGrx-1蛋白溶液中，室溫孵育48 h，將線蟲用ddH2O漂洗2次，再分別轉(zhuǎn)移至50 mmol/L H2O2溶液和45℃孵育箱，12 h后統(tǒng)計(jì)線蟲存活率。每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AbGrx-1基因序列和進(jìn)化樹分析

水稻干尖線蟲谷氧還蛋白的cDNA序列(GeneBank登錄號：KP190142)共508 bp，包括90 bp的5＇非翻譯區(qū)(UTR)、318 bp的編碼區(qū)和97 bp的3＇UTR(圖1)。ProtParam預(yù)測開發(fā)閱讀框ORF(橫跨91至411位)編碼106個氨基酸，相對分子質(zhì)量為11.65 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為8.77。AbGrx-1無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞質(zhì)。通過與NCBI上登錄的其他11種線蟲的Grx序列進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)AbGrx-1第24至27位點(diǎn)具有Grx催化殘基CYPC，分別在第69至第72和第83至第86位點(diǎn)存在保守的谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)RSVP和GGDD(圖2)。

通過NCBI/BLASTP發(fā)現(xiàn)谷氧還蛋白在人類、動植物、昆蟲和線蟲等生物有機(jī)體中保守存在。AbGrx-1 (AJE60960)與線蟲的Grx具有很高的相似性，其中與動物寄生線蟲捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(, CDJ92071)蛋白序列相似度最高，達(dá)68%(E=5× 10?47)，而棘唇線蟲(，VBB32303)相似度最低，為57%(E=2×10?43)；與植物寄生線蟲燕麥真滑刃線蟲(，AAQ20895)和草莓芽線蟲(, AFC377891)分別有67%(E=2×10?54)和64%(E=4×10?49)的相似性；與三種自由生活線蟲(CAP38709)、(EFO84822)和(EGT47413)相似性分別為67%、66%和64%。

以二斑葉螨(，XP_01578 4727)谷氧還蛋白為外圍群體，將NCBI上登錄的23個線蟲的谷氧還蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析。系統(tǒng)發(fā)育樹將線蟲的谷氧還蛋白劃分為2個大的分支，一個分支由羅阿絲蟲(，XP 020304614)、曲折盤尾絲蟲(，OZC08115)、棘唇線蟲(，VBB32303)、馬來絲蟲(，CRZ22053)以及吳策線蟲()等人類和動物寄生絲狀線蟲組成，另一個分支則包括自由生活線蟲、植物寄生線蟲以及人類和動物寄生線蟲。在目前已知的三種植物寄生線蟲中，水稻干尖線蟲AbGrx-1與燕麥真滑刃線蟲(，AAQ20895)劃歸于同一個次級分支，而與草莓芽線蟲(，AFC 377891)分屬不同次級分支(圖3)。

方框表示谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)，向下箭頭表示谷氧還蛋白的催化殘基；一致和相似的序列分別用星號和圓點(diǎn)表示。

Fig. 2. Sequences alignment ofand other nematode glutaredoxin proteins.

2.2 逆境脅迫下線蟲AbGrx-1表達(dá)水平檢測

為了檢測氧化和溫度脅迫對基因表達(dá)水平的影響，首先分析了不同濃度H2O2溶液和不同溫度處理對線蟲存活率的影響。結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的逐漸升高，線蟲的存活率逐漸下降。浸泡于100 mmol/L和250 mmol/L H2O2中24 h可導(dǎo)致80%供試線蟲死亡，48 h則導(dǎo)致供試線蟲全部死亡；而5 mmol/L和10 mmol/L H2O2溶液對于線蟲存活無較大影響，在48 h時仍有90%以上的存活率。浸泡于中間濃度25 mmol/L和50 mmol/L的H2O2溶液中，線蟲的存活率存在較大差異：浸泡于25 mmol/L H2O224 h，超過85%線蟲存活，而在50 mmol/L H2O2中，線蟲存活為38.6%(圖4-A)。在溫度逆境下，線蟲在0、4、12、25℃等較低溫度中保持較高存活率，在處理48 h時仍有超過95%存活率。隨著時間的推移和溫度的升高，暴露于37℃和45℃高溫環(huán)境下48 h，線蟲的存活率分別為54.6%和4.2%(圖4-B)。

線蟲浸泡于H2O2溶液中12 h，表達(dá)水平顯著提高，在5 mmol/L H2O2溶液中，表達(dá)水平為對照組的19.3倍，隨著H2O2濃度的提高，的表達(dá)水平下降，但都顯著高于對照組(<0.01)(圖5-A)。當(dāng)線蟲處于溫度逆境中，相比25℃，的表達(dá)水平在0℃、4℃、37℃和45℃下對顯著降低，而在12℃時表達(dá)水平顯著提高，為25℃環(huán)境中的1.5倍(<0.01)。

圖3 線蟲谷氧還蛋白的遺傳發(fā)育樹

Fig. 3. Phylogenetic relationship among different glutaredoxin proteins in the known nematodes species.

2.3 AbGrx-1蛋白提高線蟲在逆境脅迫中的存活率

為了研究AbGrx-1蛋白功能，構(gòu)建了融合表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)。通過IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳獲得一條約14 kD的蛋白條帶，與理論分子量相當(dāng)，通過Ni-IDA柱進(jìn)行洗脫純化獲得高純度的AbGrx-1蛋白(圖6-A)。將線蟲浸泡于不同濃度的AbGrx-1蛋白溶液中，隨著時間的推移和蛋白濃度的升高線蟲的存活率逐漸下降。48 h時，浸泡于50 μmol/L 蛋白溶液超過13%的線蟲死亡，而在低濃度5 μmol/L和10 μmol/L溶液中，線蟲的存活率超過90%(圖6-B)。為了檢測AbGrx蛋白是否增強(qiáng)線蟲的抗逆能力，選擇5 μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)處理。

將預(yù)先浸泡在5 μmol/L AbGrx-1蛋白溶液中的線蟲分別置于氧化和高溫逆境12 h，結(jié)果顯示，AbGrx-1蛋白預(yù)處理的線蟲在50 mmol/L H2O2溶液中的存活率為64.73%，顯著高于未預(yù)處理的41.28% (<0.01)(圖6-C)。45℃高溫脅迫下，預(yù)處理的線蟲存活率為79.81%，高于未處理的65.61%，但差異不顯著；而處于25℃環(huán)境中線蟲的存活率不受影響(圖6-D)。

圖4 氧化脅迫(A, H2O2處理)和溫度脅迫(B)下水稻干尖線蟲的存活率

Fig. 4. Cumulative survival rates ofexposed to H2O2(A) and temperature (B) stress.

柱條表示標(biāo)準(zhǔn)誤；*，**分別表示與對照(0mml/L或25℃)差異達(dá)0.05, 0.01顯著水平。

Bars are stardand error. *, ** indicate significant difference between the treatment and the CK(0mml/L or 25℃)at 0.05 and 0.01 levels. The same as in figures below.

圖5 暴露于不同濃度H2O2和不同溫度12 hAbGrx-1的相對表達(dá)水平

Fig. 5. Relative expression level of AbGrx-1exposed to H2O2and temperature stress for 12 hours.

3 討論

作為氧化還原酶，Grxs參與維持和調(diào)控胞間氧化還原平衡。目前，已有許多昆蟲的基因被克隆，表達(dá)分析也已完成。當(dāng)遭受饑餓、紫外光照射、機(jī)械損傷及高低溫逆境時，亞洲玉米螟()迅速被誘導(dǎo)表達(dá)[15]。中華蜜蜂()和受高低溫、H2O2、殺蟲劑、汞等極端因子的誘導(dǎo)[16]。棉鈴蟲()、和受不同溫度和H2O2的誘導(dǎo)[17]，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)這些Grxs具有抗氧化防御的功能。然而有關(guān)植物寄生線蟲Grx的研究十分有限。

本研究通過RACE-PCR技術(shù)克隆了水稻干尖線蟲的谷氧還蛋白。從氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上來說，AbGrx-1蛋白在所有線蟲中都高度保守?；诨钚晕稽c(diǎn)[1]，AbGrx-1與已經(jīng)報(bào)道的草莓芽線蟲谷氧還蛋白AF-GLX-1一樣，歸屬于Ⅰ類Grx[6]。盡管如此，在進(jìn)化關(guān)系上，其中一些Grx在分類上可能存在變異。NJ進(jìn)化樹分析顯示，盡管位于一個大的進(jìn)化分支，但AbGrx-1與AF-GLX-1分屬不同的次級分支，而與燕麥真滑刃線蟲、鼠類圓線蟲()和犬弓蛔蟲()的谷氧還蛋白屬于同一次級分支。

前期已有文獻(xiàn)報(bào)道，自由生活線蟲對H2O2十分敏感，低濃度H2O2浸泡能快速造成蟲體死亡[4, 18, 19]；而植物線蟲對氧化脅迫具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，例如南方根結(jié)線蟲() J2在100 mmol/L H2O2溶液中浸泡30 min，僅有10%的線蟲死亡[20]。相比根結(jié)線蟲，水稻干尖線蟲對H2O2極不敏感，在100 mmol/L和250 mmol/L的H2O2溶液中浸泡24 h仍不會全部死亡(圖4-A)。之前有研究利用H2O2溶液對水稻干尖線蟲進(jìn)行表面消毒卻不影響線蟲的活性[21, 22]，暗示水稻干尖線蟲可能利用特殊的抗氧化機(jī)制來克服外界的氧化脅迫。線蟲對溫度改變的適應(yīng)是其生存的關(guān)鍵。例如，昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲() 在低溫(5~ 25℃)下的存活率和致病性顯著高于高溫35℃[23]；腎型線蟲()在10℃時不能侵染植物，但在零下低溫環(huán)境中仍能存活6個月[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，適度的低溫脅迫不能顯著影響水稻干尖線蟲的存活，短期的高溫脅迫也不能造成全體供試線蟲死亡(圖4-B)，表明水稻干尖線蟲對溫度逆境具有極強(qiáng)的耐受力。

之前的研究表明，燕麥真滑刃線蟲()的表達(dá)不受H2O2和低溫誘導(dǎo)，而受高溫抑制[25]；而低溫能抑制草莓芽線蟲()的表達(dá)[6]。這些結(jié)果說明不同線蟲的Grx對于氧化和溫度壓力的反應(yīng)存在差異。通過監(jiān)測H2O2處理和溫度逆境下水稻干尖線蟲基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)H2O2能顯著誘導(dǎo)的表達(dá)，并且低濃度(5 mmol/L) H2O2下表達(dá)水平最高(圖5-A)?？紤]到低濃度H2O2對線蟲存活率的影響較小，推測5 mmol/L H2O2是水稻干尖線蟲蟲體損傷的臨界濃度，水稻干尖線蟲能通過誘導(dǎo)的高表達(dá)激發(fā)自身的抗氧化免疫反應(yīng)。各溫度脅迫下表達(dá)水平最多被誘導(dǎo)1.54倍(圖5-B)。當(dāng)培養(yǎng)溫度從25℃上升到31℃~33℃時，熱激蛋白Hsp90、Hsp70和小分子Hsp蛋白迅速被誘導(dǎo)合成，表現(xiàn)出典型的熱休克反應(yīng)[26]；而低溫和高溫能顯著誘導(dǎo)水稻干尖線蟲Hsp90基因上調(diào)表達(dá)[10]。因此，水稻干尖線蟲可能不通過誘導(dǎo)AbGrx-1的表達(dá)應(yīng)對溫度逆境。

A，AbGrx-1蛋白的表達(dá)和純化；M，標(biāo)記；1，純化的蛋白；2，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白；3，未誘導(dǎo)蛋白；4，空載；B，不同濃度AbGrx1溶液浸泡對線蟲存活率的影響；C~D，AbGrx-1蛋白預(yù)處理的線蟲在氧化（C）和高溫逆境（D）處理中的存活率。**表示處理與對照間差異達(dá)0.01顯著水平。

Fig. 6. Role of AbGrx-1 protein in the response ofto oxidization and temperature stresses.

Li等[27]發(fā)現(xiàn)利用蕎麥谷氧還蛋白rbGrx溶液浸泡能降低氧化脅迫和高溫逆境下蟲體內(nèi)活性氧水平，增強(qiáng)SOD、CAT等氧化酶的活性，從而提高線蟲對氧化脅迫和高溫逆境下的存活率，并延長線蟲的壽命。與之不同， AbGrx-1原核表達(dá)蛋白溶液預(yù)處理能顯著提高氧化脅迫下水稻干尖線蟲的存活率，但不能顯著降低高溫逆境導(dǎo)致的線蟲死亡率(圖6)。通過體外酶活測試，證實(shí)AbGrx-1蛋白能有效清除反應(yīng)溶液中H2O2(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，AbGrx-1蛋白能通過降低蟲體活性氧水平以減少細(xì)胞的氧化損傷，從而提高線蟲存活率。

在線蟲與寄主互作過程中，寄主能產(chǎn)生活性氧以抵御線蟲的侵染取食；為了存活，線蟲常常分泌一系列抗氧化酶抑制寄主活性氧信號的免疫反應(yīng)[20]。例如，動物病原線蟲通過SOD、GPX和CAT等抵抗ROS對其造成的損傷[28]。松材線蟲()能利用半胱氨酸過氧化物還原酶(Prx2s)弱化寄主防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)侵染[29]。根結(jié)線蟲能分泌轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(MjTTL5)與寄主植物鐵(硫)氧還蛋白還原酶催化亞基互作，清除侵染細(xì)胞活性氧完成侵染[30]。AbGrx-1作為水稻干尖線蟲抵抗氧化脅迫重要蛋白，在侵染寄主早期高度表達(dá)(結(jié)果未顯示)，暗示AbGrx-1可能參與水稻干尖線蟲與寄主互作。因此，AbGrx-1可能是水稻干尖線蟲潛在的防控靶點(diǎn)，通過抑制的表達(dá)將有助于水稻干尖線蟲病的高效防控。

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Protective Effect of Glutaredoxin (AbGrx-1) onUnder Oxidative Stress

FENG Hui2, FAN Yalei2, ZHANG Jinfeng2, ZHU Hongli1, WEI Lihui1, 2, *

(1,,,;2,,,;Corresponding author,)

The antioxidant glutaredoxin (Grx) plays a crucial role in regulating intracellular redox homeostasis via scavenging of excess reactive oxygen species. The white-tip nematodecan survive in adverse environments including high temperature,osmosis and oxidative stresses. To reveal the antioxidant function of Grx in,herein the full-length cDNA of glutaredoxin (named AbGrx-1) fromwas cloned by using rapid amplification of cDNA ends (RACE), and AbGrx-1 protein and evolutionary relationship were characterized; differential gene expression level was detected in the nematodes under oxidant and temperature stresses by using quantitative real-time PCR; the effect of the recombinant AbGrx-1 protein onsurvival was also tested.The full-lengthcDNA contains a 5' UTR of 90, an ORF of 321 bp encoding a polypeptide of 106 amino acids and a 3' UTR of 97 bp. The deduced amino acid sequence of AbGrx-1 shares a high similarity with other nematodes’ Grxs, and the catalytic residue (CPYC) and glutathione binding sites (RSVP and GGDD) indicate that AbGrx-1 is categorized into Class I Grx. The phylogenetic tree showed AbGrx-1 is located in the same clade with the plant parasitic nematode. AbGrx-1 mRNA is highly induced inexposed to H2O2solution and 12℃, but is suppressed in the nematodes at 0, 4, 37 and 45℃. The high concentration H2O2solutions and high temperature are adverse to survival of, but the survival rate increases with the nematodes pre-soaked in AbGrx-1 recombinant protein solution.AbGrx-1 is required forantioxidative immunity, and plays an essential role in overcoming oxidative damage and nematode survival.

; glutaredoxin; gene cloning; recombinant protein; antioxidation

S435.111.4+8

A

1001-7216(2019)06-0565-10

10.16819/j.1001-7216.2019.9016

2019-01-28；

2019-05-07。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31401728）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金資助項(xiàng)目[cx(17)3023]。