P-EGFR、P-ERK及NF-κB在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)研究

朱元良

摘要：目的：探討磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（P-EGFR）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（P-ERK）及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)。方法：選取本院于2018年5月-2019年5月收治的中耳膽脂瘤患者28例及正常外耳道患者13例，采用Western blot（WB）免疫印跡法、免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)其皮膚組織當(dāng)中NF-κB、P-ERK、P-EGFR的表達(dá)。結(jié)果：P-EGFR蛋白陽性表達(dá)多定位在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，NF-κB蛋白陽性表達(dá)多定位在細(xì)胞核，二者在膽脂瘤組陽性表達(dá)率均較正常外耳道皮膚組偏高（P<0.05）。經(jīng)WB免疫印跡法檢測(cè)得知，中耳膽脂瘤組P-ERK、P-EGFR與NF-κB的表達(dá)量相比正常耳道皮膚組，表達(dá)量均有顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：于中耳膽脂瘤上皮中，P-EGFR、P-ERK與NF-κB的表達(dá)均有增強(qiáng)，在此病癥形成與發(fā)展中，P-EGFR/P-ERK/NF-κB信號(hào)通路可能其重要作用。

關(guān)鍵詞：P-EGFR;P-ERK;NF-κB;中耳膽脂瘤

中耳膽脂瘤實(shí)為一種比較常見的耳科常見病，盡管為良性，但卻有著較強(qiáng)的復(fù)發(fā)性、破壞性與侵襲性，且有著并未明確的發(fā)病機(jī)制，有報(bào)道[1]指出，此病發(fā)生可能與膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡、紊亂、過度增殖相關(guān)。伴隨當(dāng)今分子生物技術(shù)的持續(xù)更新與完善，膽脂瘤發(fā)病機(jī)制當(dāng)中，細(xì)胞因子所起到的作用越發(fā)受到重視。本文針對(duì)中耳膽脂瘤的上皮組織，就磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（P-EGFR）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（P-ERK）及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）在其中的表達(dá)情況作一探討。

1.材料與方法

1.1組織標(biāo)本與試劑

于2018年5月-2019年5月，選取本院收治的28例后天性中耳膽脂瘤患者，將其當(dāng)作觀察組，另選取15例外耳道正?；颊邽閷?duì)照組，均取其皮膚組織標(biāo)本，將一半用石蠟包埋并切片，并蘇木精-伊紅進(jìn)行染色，而另外一半則放置到液氮中，當(dāng)作WB的實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本。

試劑為：ECL發(fā)光液（美國Thermo pierce）、RIPA裂解液（北京普利萊）、鼠抗人P-ERK單克隆抗體、兔抗人P-EGFR多克隆抗體（均購自SantaCruz公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

先進(jìn)行烤片、脫蠟、水化等操作，基于0.01M枸櫞酸鉀緩沖液持續(xù)高壓下，實(shí)施抗原修復(fù)。利用山羊血清實(shí)施有針對(duì)性的抗原封閉，然后，孵育一抗，放入冰箱中（4℃）。過夜后，第2d復(fù)溫，使其溫度達(dá)室溫，用PBS進(jìn)行浸泡，然后孵育二抗，時(shí)間為15min，采用PBS進(jìn)行沖洗，后于室溫下，對(duì)辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素進(jìn)行孵育（時(shí)間為15min），PBS進(jìn)行沖洗。利用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行染色，于顯微鏡直視下，對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制。已知曉的陽性切片當(dāng)作陽性對(duì)照，而將PBS緩沖液代替一抗當(dāng)作陰性對(duì)照。

1.2.2WB免疫印跡法

取組織，用冰將PBS預(yù)冷，后對(duì)組織進(jìn)行清洗，在勻漿器中，將RIPA裂解液加入，對(duì)組織進(jìn)行反復(fù)研磨，直至組織塊消失。放在冰上，裂解蛋白，時(shí)間為30min。移到離心管，12000rpm，溫度為4℃，時(shí)間為15min，離心處理，轉(zhuǎn)移上清液，備用。對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)施配膠、上樣等操作，調(diào)節(jié)濃縮膠電泳的電壓，即80V，將分離膠的電泳電壓控制在120V，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳到離膠底大約1cm時(shí)，將電泳終止。孵育一抗、二抗，用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，用定影液將顯色終止。曝光底片后，掃描操作，專業(yè)灰度分析軟件（quantity one）分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS20.0處理數(shù)據(jù)，百分率表示計(jì)數(shù)資料（X2檢驗(yàn)），P<0.05表示差異顯著。

2.結(jié)果

細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)為P-EGFR蛋白陽性表達(dá)的主要定位處，其于膽脂瘤組陽性表達(dá)率為57.14%（16/28），較正常外耳道皮膚組10.71%（3/28），顯著偏高（P<0.05）。NF-κB蛋白陽性表達(dá)多定位在細(xì)胞核，其于膽脂瘤組陽性表達(dá)率為71.43%（20/28），相比正常外耳道皮膚組10.71%（3/28），明顯偏高（P<0.05）。經(jīng)WB免疫印跡法檢測(cè)得知，中耳膽脂瘤組P-ERK、P-EGFR與NF-κB的表達(dá)量相比正常耳道皮膚組組，表達(dá)量均有顯著升高（P<0.05）。

3.討論

EGFR實(shí)為一個(gè)具有比較明顯的酪氨酸蛋白激酶活性，且大小為170kDa的表皮生長(zhǎng)因子受體，由三部分組成，即胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)與胞外區(qū)。當(dāng)胞外部分結(jié)合配體后，能形成P-EGFR，將下游信號(hào)通路激活，因而可以加速細(xì)胞增殖、遷移等[2]。而對(duì)于ERK蛋白而言，其實(shí)為絲氨酸-蘇氨酸激酶亞家族，在相關(guān)成員當(dāng)中，當(dāng)前研究最多的是ERK2、ERK1。從根本上來講，在整個(gè)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路架構(gòu)當(dāng)中，ERK1/2為其基礎(chǔ)構(gòu)成，其能夠與細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，由細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，對(duì)重要蛋白活性加以控制，最終達(dá)到調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡及增殖的目的。對(duì)于NF-κB來講，其作為一種轉(zhuǎn)錄因子，提取于B淋巴細(xì)胞當(dāng)中，其能夠參與許多基因的調(diào)控，還參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化具有調(diào)節(jié)作用，還能加速腫瘤發(fā)展[3]。本文針對(duì)中耳膽脂瘤患者，就上述物質(zhì)在其上皮組織中的表達(dá)作一分析，由結(jié)果得知，P-EGFR、NF-κB在膽脂瘤組陽性表達(dá)率均高于正常外耳道皮膚組。而經(jīng)WB免疫印跡法檢測(cè)現(xiàn)實(shí)，中耳膽脂瘤組P-ERK、P-EGFR與NF-κB的表達(dá)量均高于正常耳道皮膚組。提示P-EGFR、P-ERK與NF-κB的表達(dá)在中耳膽脂瘤的形成與發(fā)展中，均起到重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李強(qiáng)，江紅群，陳亞琴，等.長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR在中耳膽脂瘤中的表達(dá)[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2017，31 （4）：250-253.

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[3]郝艷，李珂，王建亭，等.NF-κBP65和caspase-3在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及其臨床意義[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，42 （4）：288-291.