發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵劑種類對牛肉調(diào)味料風(fēng)味的影響

吳晨燕 馬儷珍 周偉 熊鳳嬌 仇泓博

摘 要：為研究發(fā)酵劑種類和發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵牛肉調(diào)味基料（fermented beef flavorings，F(xiàn)BF）風(fēng)味的影響，將發(fā)酵劑THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）及清酒乳桿菌（Lactobacillus sake，LS）分別接種于牛骨肉酶解液中發(fā)酵12 h和16 h制作FBF，同時(shí)設(shè)置不發(fā)酵的對照組，采用電子鼻、電子舌、氣相色譜-離子遷移譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析不同組別FBF的風(fēng)味差異和揮發(fā)性化合物組成。結(jié)果表明：對照組與發(fā)酵組FBF的氣味和滋味均存在較大差異，其中，LS組和VHI-41組FBF風(fēng)味具有特殊性;含硫化合物和醛類化合物是FBF中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，醇類、酮類化合物對FBF的總體風(fēng)味有重要的修飾作用，2-甲基-3-呋喃硫醇和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫及壬醛的相對含量是引起處理組FBF風(fēng)味差異的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵牛肉調(diào)味基料;發(fā)酵時(shí)間;發(fā)酵劑種類;揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

Abstract： The effects of different starter cultures and fermentation times on the flavor of fermented beef flavorings （FBF） were studied. FBF were Maillard reaction products derived from an enzymatic hydolysate of bovine bones fermented for 12 or 16 h with THM-17 （Staphylococcus xylosus + Pediococcus pentosaceus）， WBL-45 （Staphylococcus xylosus +?Staphylococcus carnosus + Lactobacillus sakei）， VHI-41 （Staphylococcus xylosus + Pediococcus pentosaceus + Lactobacillus plantarum） or Lactobacillus sakei （LS）. The flavor characteristics and volatile components of FBF were analyzed by gas chromatography-ion mobility spectrometry， gas chromatography-mass spectrometry， an electronic tongue and an electronic nose. The results showed that there were significant differences in flavor and taste between FBF and the unfermented control. FBF prepared with LS or VHI-41 had distinctive flavors. Sulfur-containing compounds and aldehydes were the key flavor compounds in FBF. Alcohols and ketones played an important role in modifying the overall flavor of FBF. The flavor difference among the nine groups may be ascribed to the relative contents of 2-methyl-3-furanethiol and?

bis （2-methyl-3-furyl） disulfide and nonanal.

Keywords： fermented beef flavorings; fermentation time; starter culture; volatile flavor substances

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190815-182

中圖分類號：TS251.9 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）09-0042-06

引文格式：

吳晨燕， 馬儷珍， 周偉， 等. 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵劑種類對牛肉調(diào)味料風(fēng)味的影響[J]. 肉類研究， 2019， 33（9）： 42-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190815-182. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

WU Chenyan， MA Lizhen， ZHOU Wei， et al. Effects of fermentation time and starter cultures on flavor of beef flavorings[J]. Meat Research， 2019， 33（9）： 42-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190815-182. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 電子鼻測定

參考張鑫等[15]的方法，并作適當(dāng)修改。吸取1 mL樣品，密封至專用瓶中;樣品在HeraclesⅡ超快速氣相色譜電子鼻上進(jìn)行測定分析。進(jìn)樣、檢測條件：進(jìn)樣體積300 ?L，孵化溫度50 ℃，捕獲溫度50 ℃，檢測器溫度250 ℃。

1.3.3.2 電子舌測定

參考李陽等[16]的方法，并作適當(dāng)修改。將樣品稀釋30 倍，過0.45 μm水系濾膜后置于電子舌專用燒杯中待測;檢測器由7 根具有特異選擇性的傳感器（ZZ、BA、CA、HA、GA、BB、JB）組成，通過電壓值信號對不同樣品的差異進(jìn)行判別。

1.3.3.3 GC-IMS分析

參考王輝等[17]的方法，并作適當(dāng)修改。樣品處理：取FBF 1 mL，置于20 mL頂空瓶中，每個(gè)樣品取2 份平行樣，放入儀器樣品盤上進(jìn)行自動進(jìn)樣分析。自動進(jìn)樣條件：孵育時(shí)間20 min，溫度60 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，進(jìn)樣針溫度85 ℃，進(jìn)樣體積500 ?L，進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣，不分流。GC條件：FS-SE-54-CB-1石英毛細(xì)管柱（15 m×0.53 mm，1 μm），色譜柱溫度60 ℃，載氣為N2（純度≥99.999%）。載氣流速：初始2 mL/min，保持2 min后，8 min內(nèi)線性上升至15 mL/min，10 min內(nèi)線性上升至80 mL/min，5 min內(nèi)線性上升至130 mL/min，總運(yùn)行時(shí)間25 min。IMS條件：IMS溫度45 ℃，漂移氣為N2（純度≥99.999%），遷移氣流速為恒速150 mL/min，遷移管長度98 mm，管內(nèi)線性電壓500 V/cm;放射源：β射線（氚，3H）;離子化模式：正離子。

1.3.3.4 GC-MS分析

固相微萃取條件：75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，萃取時(shí)間40 min，萃取溫度60 ℃。GC條件：VF-5ms柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;柱溫：初始溫度40 ℃，保持4 min后以5 ℃/min升至終溫240 ℃并保持5 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;分流比5;柱流速1.0 mL/min;載氣He（純度99.999%）。MS條件：掃描范圍：采集質(zhì)量范圍50～1 000（m/z）;傳輸溫度280 ℃;離子阱溫度220 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Sigma plot 10.0軟件繪圖;用Statistix 8.1軟件中的Tukey HSD進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P<0.05），用Gallery Plot插件進(jìn)行指紋圖譜對比;采用Alphasoft V 12.46軟件進(jìn)行電子鼻數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 FBF的電子鼻分析結(jié)果

不同處理組之間相對距離越遠(yuǎn)，說明彼此氣味差異越大。由表1可知：CK組和各發(fā)酵組FBF均能很好地分開，說明發(fā)酵處理使得CK組和發(fā)酵組氣味差異較大;發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，THM-17、WBL-45、VHI-41、LS4組間均有不同程度的分散，其中，THM-17、WBL-45組相對距離較近，VHI-41、LS組在所有處理組中的分散程度較大，由此說明，發(fā)酵劑種類對FBF產(chǎn)物的揮發(fā)性氣味影響較大;當(dāng)發(fā)酵劑種類相同、發(fā)酵時(shí)間不同時(shí)，LS-12、LS-16組間的差異最大，相對距離為45 863.94;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，采用不同發(fā)酵劑制得的FBF氣味差異增大。綜合來看，VHI-41組FBF與其他發(fā)酵組差異較大，發(fā)酵時(shí)間對LS組風(fēng)味影響更大。

2.2 FBF的電子舌分析結(jié)果

由表2可知：CK組與各發(fā)酵組FBF之間的相對距離較大，說明發(fā)酵對FBF的滋味影響較大;發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，不同發(fā)酵劑組FBF滋味的相對距離存在差異，說明發(fā)酵劑種類會影響FBF的最終滋味，其中，THM-17和WBL-45組、VHI-41和LS組之間的差異相對較小;發(fā)酵時(shí)間同樣會對FBF的非揮發(fā)性成分造成影響，且發(fā)酵時(shí)間會加大不同發(fā)酵劑組之間的差異。

2.3 FBF的GC-IMS分析結(jié)果

GC-IMS能夠明確引起不同處理組風(fēng)味差異的化合物，適合小分子物質(zhì)的檢測。GC-IMS分析結(jié)果表明，F(xiàn)BF發(fā)酵劑相同時(shí)，發(fā)酵12 h和16 h的風(fēng)味差異較小;FBF發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，THM-17、WBL-45組風(fēng)味較相似，LS、VHI-41組風(fēng)味較特殊。GC-IMS分析除進(jìn)一步驗(yàn)證了電子鼻、電子舌的測定結(jié)果外，還可以明確引起不同處理組間差異的小分子物質(zhì)：與CK組相比，發(fā)酵處理使呋喃酮、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、戊醛等組分含量升高，壬醛、正辛醛、2-戊酮、2-壬酮、3-戊酮、2-正戊基呋喃等組分含量降低，CK組和發(fā)酵組FBF的總體風(fēng)味存在較大差異;經(jīng)LS發(fā)酵后，3-辛酮、正己醇、3-辛醇、正辛醇等物質(zhì)含量明顯變大，LS組FBF風(fēng)味獨(dú)特。

2.4 FBF的GC-MS分析結(jié)果

結(jié)合計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，采用峰面積歸一化法測得各揮發(fā)性組分的相對含量[18]。各處理組鑒定出的揮發(fā)性化合物占FBF中揮發(fā)性化合物總量的比例均達(dá)到99%以上，說明各處理組揮發(fā)性化合物均被得到較好地分離、鑒定。

由表3可知：各處理組FBF揮發(fā)性化合物中含硫化合物占較大比例，其次是醛類、醇類、烴類、酯類、酸類、酮類、酚類及其他。根據(jù)食品風(fēng)味研究的一般方法可以確定，含硫化合物是FBF中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。9 組樣品中共有9 種主要風(fēng)味化合物（相對含量>1%）（正辛醛、壬醛、十六醛、3-甲基噻吩醛、癸醛、2，4-二甲基苯甲醛、1，3-二氨基丁硫醇、4-甲基-5-（羥乙基）噻唑和2，4-二叔丁基苯酚），其中包含6 種醛類物質(zhì)、2 種含硫化合物、1 種酚類物質(zhì)，進(jìn)一步表明醛類化合物和含硫化合物是FBF中重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2.4.1 含硫化合物

在牛肉香味構(gòu)成中，含硫化合物是肉味香精中基本肉香味的主要來源。FBF中共檢測出6 種含硫化合物，共有的含硫化合物中，4-甲基-5-（羥乙基）噻唑相對含量達(dá)30%以上，其呈味特征為肉香、烤香、堅(jiān)果香[1]、強(qiáng)烈乳香[19]，但因其感覺閾值較高，對FBF風(fēng)味影響較小;1，3-二氨基丁硫醇在CK組和發(fā)酵組中的相對含量差異較大，與CK組相比，發(fā)酵組FBF中1，3-二氨基丁硫醇相對含量增加，其中，VHI-41組相對含量與其他發(fā)酵處理組差異較大，說明1，3-二氨基丁硫醇可能是造成不同處理組FBF之間風(fēng)味差異的化合物之一。2-甲基-3-呋喃硫醇和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫是目前國內(nèi)外公認(rèn)的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[20-21]，主要由含硫化合物提供。結(jié)合感覺閾值判斷，2-甲基-3-呋喃硫醇和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫可能是引起9 組樣品風(fēng)味差異的主要物質(zhì)。2-甲基-3-呋喃硫醇的呈味特征為肉香、烤香、烤雞肉香，在肉味香精中常被用作頭香和體香;雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫的呈味特征為飽滿的肉香、燉肉香，在肉味香精中常被用作體香。

2.4.2 醛類化合物

醛類化合物由美拉德反應(yīng)過程中脂肪酸降解產(chǎn)生[22]，醛類物質(zhì)可以使肉味香料的風(fēng)味更加圓潤、有層次感[23]，為整體風(fēng)味提供脂香[24]。正辛醛、壬醛、十六醛、3-甲基噻吩醛、癸醛和2，4-二甲基苯甲醛是9 組FBF中共有且相對含量較高（>1%）的醛類化合物。其中，壬醛有水果香、柑橘香[25]。壬醛在醛類化合物中相對含量最高且閾值較低，CK組壬醛相對含量最高（15.78%），各發(fā)酵組壬醛相對含量差異較大，隨著發(fā)酵時(shí)間從12 h延長至16 h，WBL-45組壬醛相對含量相對穩(wěn)定，THM-17組壬醛相對含量較低，但呈上升趨勢，另外2 個(gè)發(fā)酵組壬醛相對含量呈下降趨勢。4-甲基噻唑-5-甲醛為VHI41-12組特有，其相對含量為1.25%。研究表明，低級醛類（C4以下）有刺激性，中級醛類（C5～C12）呈花果香味[26]。

2.4.3 醇類化合物

飽和醇類對食品總體風(fēng)味起協(xié)同作用，不飽和醇類對食品風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[27]。CK組FBF中醇類化合物種類較少，且在總揮發(fā)性化合物中所占比例較小。經(jīng)發(fā)酵處理后FBF中醇類物質(zhì)種類及相對含量均增加。正辛醇存在于THM-17組和LS組中，相對含量較高，能帶來柑橘清香[28]，但因其閾值較高，故對風(fēng)味影響貢獻(xiàn)較小。

1-壬醇（玫瑰香、橙子香，并伴有油脂氣息）[29]在LS組中相對含量較高，其他發(fā)酵組未檢出或相對含量較?。?1%），因此認(rèn)為，1-壬醇是LS組FBF的重要風(fēng)味物質(zhì)。此外，N-非甾烷醇-1可能是WBL45-12組中起貢獻(xiàn)作用的風(fēng)味物質(zhì)，2-乙基己醇則對WBL45-16組FBF的風(fēng)味起重要作用。

2.4.4 烴類、酯類、酸類、酮類、酚類及其他化合物

烴類化合物閾值一般較高，香氣較弱或無香氣，對風(fēng)味的直接貢獻(xiàn)作用較小。但烴類化合物是形成對肉風(fēng)味有貢獻(xiàn)作用的雜環(huán)化合物的重要中間體，對風(fēng)味形成有重要的基底作用[18]。經(jīng)VHI-41發(fā)酵16 h制成的FBF中烴類化合物種類和相對含量明顯增加;WBL-45發(fā)酵16 h制成的FBF中，1，2-二苯氧基乙烷相對含量較高，達(dá)1.31%。

酯類化合物多具有特殊氣味，能起到調(diào)味作用，從而賦予食品水果清香、花香及蜂蜜的味道[30]。鄰苯二甲酸二異丁酯（馬鈴薯泥特征香氣）[31]和水楊酸-2-乙基己基酯可能是引起不同處理組FBF風(fēng)味差異的主要酯類化合物。

酸類化合物主要存在于發(fā)酵組FBF中，CK組檢測出的酸類物質(zhì)種類較少，且相對含量較低。5-甲基-4，5-二氫異噁唑-5-羧酸是8 組發(fā)酵處理組FBF共有的主要酸類化合物，其在VHI-41組和LS組中相對含量較高（>1%）。辛酸（清香、微弱的水果酸香氣、淡酸味）[32]為LS-12組FBF特有的酸類化合物，但因其感覺閾值很高，對風(fēng)味影響可能起協(xié)同作用。

酮類化合物香味持久，且具有特殊清香，但因其感覺閾值較高，對氣味的貢獻(xiàn)相對較小[18]。隨著發(fā)酵時(shí)間從12 h延長至16 h，不同發(fā)酵組FBF中的酮類化合物種類及相對含量均有所降低，如WBL-45組發(fā)酵12 h和16 h時(shí)，2-十五烷酮的相對含量由0.27%降至0.16%。由此判斷，酮類化合物是對CK組與發(fā)酵組FBF風(fēng)味差異有貢獻(xiàn)的化合物。

正-午基醚在THM17-12、THM17-16、WBL45-12組FBF中的相對含量分別為1.10%、1.09%、1.04%，CK組相對含量為0.37%，結(jié)合電子鼻結(jié)果分析，CK組、THM-17組、WBL-45組間相對距離較近，正-午基醚可能也是起貢獻(xiàn)作用的化合物。

3 討 論

美拉德反應(yīng)主要產(chǎn)生含硫化合物，醛類化合物則是脂肪酸降解的主要產(chǎn)物。結(jié)合本研究所用發(fā)酵劑的組成分析，清酒乳桿菌、戊糖片球菌及植物乳桿菌在代謝過程中能產(chǎn)生大量乳酸，在肉制品應(yīng)用中主要起抑菌作用[14];木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌能夠通過分解蛋白質(zhì)和脂肪[33]，延緩脂肪氧化源風(fēng)味物質(zhì)的生成速率[34]，促進(jìn)肉制品風(fēng)味的形成。根據(jù)4 種發(fā)酵劑的組成可知，F(xiàn)BF的風(fēng)味主要由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，發(fā)酵劑中肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的存在可以延緩脂肪氧化，從而影響醛類物質(zhì)的形成，LS組發(fā)酵劑為單株的清酒乳桿菌，其他3 種發(fā)酵劑均含葡萄球菌屬，因此LS組FBF的關(guān)鍵風(fēng)味化合物組成與其他處理組存在差異。VHI-41-12組FBF風(fēng)味與其他處理組差異較大，且最被接受，構(gòu)成該組FBF總體風(fēng)味的關(guān)鍵化合物有3 種，其中，2-甲基-3-呋喃硫醇是貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)，雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫、壬醛等化合物對該組FBF風(fēng)味的貢獻(xiàn)也比其他發(fā)酵組高。關(guān)鍵化合物種類多且風(fēng)味貢獻(xiàn)較大是VHI-41-12組FBF風(fēng)味獨(dú)特、更受歡迎的原因。

2-甲基-3-呋喃硫醇作為最關(guān)鍵的風(fēng)味物質(zhì)，生成后易氧化降解為二硫醚類化合物[35]。分別對比各發(fā)酵組FBF發(fā)酵12 h和16 h的關(guān)鍵風(fēng)味化合物差異，結(jié)果表明，發(fā)酵12 h時(shí)的關(guān)鍵風(fēng)味化合物有2-甲基-3-呋喃硫醇、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫及壬醛;發(fā)酵16 h的關(guān)鍵風(fēng)味化合物為2-甲基-3-呋喃硫醇及壬醛，由此可知，F(xiàn)BF的風(fēng)味主要通過美拉德反應(yīng)生成的含硫化合物提供，發(fā)酵過程通過影響和控制2-甲基-3-呋喃硫醇的氧化降解對FBF的最終風(fēng)味產(chǎn)生影響，不同發(fā)酵劑因組成不同，對該關(guān)鍵風(fēng)味化合物的影響存在差異。

4 結(jié) 論

針對發(fā)酵劑種類和發(fā)酵時(shí)間對FBF風(fēng)味的影響展開研究。結(jié)果表明：發(fā)酵時(shí)間可以影響FBF中風(fēng)味化合物的生成量，對FBF風(fēng)味和滋味差異影響較小;發(fā)酵劑種類能夠影響FBF中風(fēng)味化合物的種類，對風(fēng)味和滋味影響較大;THM-17、WBL-45組FBF風(fēng)味較相似，LS、VHI-41組FBF風(fēng)味特殊;通過對關(guān)鍵風(fēng)味化合物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2-甲基-3-呋喃硫醇、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫和壬醛是形成FBF香氣的主體風(fēng)味物質(zhì)，2-甲基-3-呋喃硫醇和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫2 種組分在處理組中的相對含量差異是引起FBF風(fēng)味差異的主要原因。

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