氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏期間理化指標(biāo)變化及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定

李德紅 祝傳海 岳曉霞 王璇 呂云雄 劉俊杞 張根生

摘 要：為研究氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏條件下貯藏品質(zhì)的變化，將未加抑菌劑的氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管在冷藏（0～4 ℃）條件下貯存12 d，分別測(cè)定其pH值、水分活度、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值、感官評(píng)分及微生物菌相等指標(biāo)的變化。結(jié)果表明：隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的感官品質(zhì)顯著降低、pH值顯著下降，而TBARs值呈顯著上升趨勢(shì)，水分活度呈下降趨勢(shì)，但下降幅度很小;將分離純化后的腐敗菌采用16S rDNA測(cè)序方法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)冷藏條件下氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要有副黃假單胞菌、特基拉芽孢桿菌、肉芽腫克雷伯氏菌和香坊腸桿菌。

關(guān)鍵詞：氣調(diào)包裝;醬鹵鴨食管;理化指標(biāo);優(yōu)勢(shì)腐敗菌

Abstract： In order to study the quality changes of modified atmosphere-packaged （MPA） sauced duck esophagus under cold storage conditions， MPA sauced duck esophagus without any antimicrobial was stored under refrigeration （0–4 ℃） for 12 days. Changes in pH value， water activity， thiobarbituric acid reactive substance （TBARs） value， sensory evaluation score and microbial flora were determined during the storage period. The results showed that with the prolongation of storage time， the sensory quality of MPA duck esophagus decreased significantly， and so did the pH value. In addition， the TBARs value showed a significant upward trend， while the water activity decreased but only slightly. The dominant spoilage bacteria in MPA sauced duck esophagus were Pseudomonas parafulva， Bacillus tequilensis and Klebsiella granulomatis and Enterobacter xiangfangensis， as identified by 16S rDNA sequencing.

Keywords： modified atmosphere packaging; sauced duck esophagus; physicochemical indicators; dominant spoilage bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149

中圖分類號(hào)：TS251.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）09-0059-05

引文格式：

李德紅， 岳曉霞， 張根生， 等. 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏期間理化指標(biāo)變化及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定[J]. 肉類研究， 2019， 33（9）： 59-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

LI Dehong， YUE Xiaoxia， ZHANG Gensheng， et al. Sauced duck esophagus： changes in physicochemical indexes during cold storage in modified atmosphere packaging and isolation and identification of dominant spoilage bacteria[J]. Meat Research， 2019， 33（9）： 59-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

鴨食管又名鴨郡把、鴨胰胃，位于鴨胗和鴨食帶連接的位置，其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受我國(guó)消費(fèi)者的喜愛，是我國(guó)傳統(tǒng)食材之一[1-2]。醬鹵鴨食管屬于低溫肉制品，一般為散賣，這制約了其貯藏期間的品質(zhì)和貨架期穩(wěn)定性[3]。目前針對(duì)醬鹵鴨肉制品的研究主要集中在工藝參數(shù)優(yōu)化和貯藏品質(zhì)研究[4-5]，對(duì)于其優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定方面的研究尚需完善，尤其是對(duì)于醬鹵鴨食管的研究鮮有報(bào)道。

氣調(diào)包裝是指通過調(diào)節(jié)食品包裝環(huán)境氣體的構(gòu)成來延長(zhǎng)食品壽命和貨架期的一種食品包裝技術(shù)[6-7]。氣調(diào)保鮮技術(shù)在果蔬保鮮中的應(yīng)用比較廣泛，但現(xiàn)在也開始應(yīng)用于肉類、水產(chǎn)品及焙烤食品等方便食品保鮮[8]。氣調(diào)保鮮肉類產(chǎn)品有較長(zhǎng)的保鮮期和貨架期，較好地保持了肉類原有的品質(zhì)、色澤、風(fēng)味、口感及營(yíng)養(yǎng)，提升了肉類產(chǎn)品的食用價(jià)值。

在不同溫度條件下，食品的理化指標(biāo)和菌相結(jié)構(gòu)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均會(huì)發(fā)生很大變化。李鳴等[9]研究不同貯藏溫度對(duì)氣調(diào)包裝白切雞pH值、色度、貯藏?fù)p失等理化指標(biāo)以及微生物指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，4 ℃冷藏能有效延長(zhǎng)該產(chǎn)品的貨架期。劉子宇等[10]采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基及多種選擇性培養(yǎng)基，分離篩選和初步鑒定普通冷卻豬肉中的主要微生物菌群，結(jié)果表明，可能引起冷卻豬肉腐敗的微生物主要包括李斯特氏菌屬、腸桿菌科、假單孢菌屬、乳酸菌屬（主要是乳酸球菌）及熱殺索絲菌屬。

本研究主要對(duì)冷藏期間氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的理化指標(biāo)變化及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定進(jìn)行研究，為氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碘乙酸鈉（分析純） 西隴化工股份有限公司;氯化鉀（分析純） 天津市大陸化學(xué)試劑廠;三氯乙酸（分析純） 天津歐博凱化工有限公司;硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（分析純） 天津市新精細(xì)化工開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS高速離心機(jī) 黑龍江嘉禾廣博進(jìn)出口有限公司;CS-800色差儀 杭州彩譜科技有限公司;V-5000分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海百典儀器設(shè)備有限公司;HBD5-MS2123Wa水分活度測(cè)試儀 北京金洋萬(wàn)達(dá)科技有限公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;AV-608全自動(dòng)復(fù)合氣調(diào)包裝機(jī) 蘇州德森包裝機(jī)械有限公司;Sartorious-PB-10 pH計(jì) 廣州市深華生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的制作

原料經(jīng)過焯水至斷生后用老湯鹵煮1 h，鹵煮后的鴨食管在冷卻室（4 ℃）冷卻，切割成5～6 cm后裝盒，經(jīng)氣調(diào)包裝后，于冷藏（0～4 ℃）條件下貯存12 d。氣調(diào)包裝條件為75%氮?dú)?25%二氧化碳。

1.3.2 pH值測(cè)定

參照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測(cè)定》[11]，并稍作改動(dòng)。稱取10 g醬鹵鴨食管肉樣，將其剪碎，加入90 mL pH值測(cè)定液（5 mmol/L碘乙酸鈉與0.15 mol/L氯化鉀混合液）搖勻，在室溫條件下用校準(zhǔn)后的pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.3.3 水分活度測(cè)定

參照GB 5009.238—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品水分活度的測(cè)定》[13]。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值測(cè)定取10 g剪碎后的醬鹵鴨食管，加入25 mL 25%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），再加入20 mL蒸餾水，高速均質(zhì)30 s，3 000 r/min離心20 min后用濾紙過濾;取上清液2 mL，加入2 mL 0.02 mo1/L TBA，沸水浴20 min，流水冷卻5 min后在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度;取25 mL 25% TCA，加入20 mL蒸餾水，取混合液2 mL再加入2 mL TBA作為空白對(duì)照[14-15]。

1.3.5 感官評(píng)定

采用定量描述性分析方法對(duì)醬鹵鴨食管進(jìn)行感官評(píng)定。采用9 cm線性尺度為評(píng)分標(biāo)尺，10 名品評(píng)員參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》[16]和姚來斌等[17]方法中的感官評(píng)分要求對(duì)樣品的色澤、口感、氣味、風(fēng)味、組織狀態(tài)及總體可接受度進(jìn)行評(píng)分。最高分為9 分，最低分為1 分。醬鹵鴨食管的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.6 菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[18]。

1.3.7 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定

將介于腐敗和未腐敗臨界點(diǎn)之間的氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管按菌落總數(shù)測(cè)定方法進(jìn)行梯度稀釋，選擇3 個(gè)合適的稀釋度，傾注于各培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度重復(fù)5 次，30 ℃培養(yǎng)72 h，選取菌落總數(shù)30～300 個(gè)的平板[19]。通過菌落形態(tài)特征觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行菌株的篩選分組，挑取單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)、編號(hào)，然后采用不同的培養(yǎng)基平板進(jìn)行純化。得到的純種菌株制成甘油菌懸液，于-80 ℃超低溫冰箱中保藏。

將超低溫保藏的菌株進(jìn)行活化，并用酚/氯仿抽提法提取其基因組DNA[20]，采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進(jìn)行16S rRNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積25 ?L，包括DNA模板2.0 ?L、正反向引物各0.6 ?L（0.2 ?mol/L）、Taq酶1 ?L、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.6 ?L、Mg2+ 1.5 ?L，加重蒸水至25 ?L。PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性4 min后，按照94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min進(jìn)行28 個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)符合測(cè)序要求，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列在Ez Taxon server 2.1軟件中進(jìn)行比對(duì)分析，獲得初步鑒定結(jié)果。用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，從而獲得菌群結(jié)構(gòu)和功能信息[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為3 次實(shí)驗(yàn)的平均值，使用Statistix 7.0軟件中的Linear Models程序進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析（P<0.05），利用Origin 8.0軟件（美國(guó)Microcal公司）繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中pH值的變化小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

由圖1可知：在冷藏條件下，氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管pH值呈顯著下降趨勢(shì)（P<0.05），變化范圍為5.8～6.0，且下降趨勢(shì)較平緩;冷藏10 d時(shí)，醬鹵鴨食管pH值大幅降低，結(jié)合感官評(píng)價(jià)得到，產(chǎn)品品質(zhì)急劇下降;冷藏初期，醬鹵鴨食管的pH值為5.99，冷藏末期降為5.81。結(jié)合醬鹵鴨食管中優(yōu)勢(shì)腐敗菌分離鑒定結(jié)果及包裝環(huán)境分析，其pH值下降可能是微生物發(fā)酵糖類或包裝內(nèi)的CO2溶解在鴨食管內(nèi)形成碳酸類物質(zhì)產(chǎn)酸造成的[22-23]。

2.2 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中水分活度的變化

由圖2可知：氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的初始水分活度接近1.000，水分活度大于0.9非常有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖;隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，醬鹵鴨食管會(huì)由于氧化析出一部分水分[24]，但是由于醬鹵鴨食管的冷藏環(huán)境是無(wú)氧且低溫的，因此其水分活度呈下降趨勢(shì)（P<0.05），但下降幅度較小，在12 d的冷藏期內(nèi)，其水分活度始終處于0.980～1.000之間。

2.3 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中TBARs值的變化

由圖3可知：隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管TBARs值呈上升趨勢(shì)，且差異顯著（P<0.05）;氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管初始TBARs值約為0.1 mg/kg，貯藏末期為0.4 mg/kg左右，雖然沒超過0.5 mg/kg，未能使脂肪出現(xiàn)哈喇味，但也表明產(chǎn)品脂肪在貯藏過程中發(fā)生了氧化。

2.4 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中感官品質(zhì)的變化

由圖4可知，冷藏1～7 d時(shí)，氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)，貯藏時(shí)前期的感官品質(zhì)下降較緩慢，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的感官品質(zhì)一直比較穩(wěn)定，但是由于產(chǎn)品水分及蛋白質(zhì)含量較高，貯藏后期由于蛋白質(zhì)變質(zhì)及微生物繁殖產(chǎn)酸導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)令人不愉快的酸臭味[25-26]，產(chǎn)品表面也有發(fā)黏滲水現(xiàn)象發(fā)生。到冷藏第7天時(shí)，產(chǎn)品的感官品質(zhì)已經(jīng)表明其不適合食用。

2.5 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中菌落總數(shù)的變化

由圖5可知：氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的初始（冷藏1 d）菌落總數(shù)為2.6 （lg（CFU/g）），在冷藏條件下，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì);貯藏末期，產(chǎn)品的菌落總數(shù)為5.25 （lg（CFU/g））左右，已經(jīng)大大超過GB 2726—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》[27]中醬鹵肉制品菌落總數(shù)不得超過80 000 CFU/g的標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定結(jié)果

經(jīng)過一系列的分離、純化、篩選，共分離出69 株菌。由表2可知，經(jīng)過菌落形態(tài)、菌株形態(tài)以及相關(guān)指標(biāo)分析，將69 株菌共分為4 類菌群，其中菌株1占41%、菌株2占25%、菌株3占22%、菌株4占12%。

由圖6可知：菌株1與香坊腸桿菌（Enterobacter xiangfangensis）的同源性最高，相似度為99.70%;菌株2與特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）的同源性最高，相似度為99.85%;菌株3與副黃假單胞菌（Pseudomonas parafulva）的同源性最高，相似度為100.00%;菌株4與肉芽腫克雷伯氏菌（Klebsiella granulomatis）的同源性最高，相似度為99.68%。腸桿菌屬、芽孢桿菌屬及假單胞菌屬的微生物是食品中比較常見的腐敗微生物，在冷藏條件下仍然比較活躍，繁殖能力較強(qiáng)[28]?？死撞暇鷮俚奈⑸锸乔蓊愔休^為常見的微生物[29]。鴨食管在生產(chǎn)過程中要進(jìn)行燙漂、鹵煮等過程，經(jīng)過冷藏，克雷伯氏菌仍然會(huì)有殘留。葉可萍等[30]在研究氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅中得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要有嗜冷桿菌，這是由于檢測(cè)部位、原材料及生產(chǎn)工藝的不同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有所差異。香坊腸桿菌、特基拉芽孢桿菌、副黃假單胞菌以及肉芽腫克雷伯氏菌在繁殖過程中均會(huì)有不同程度的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣生物反應(yīng)，結(jié)合醬鹵鴨食管冷藏后期會(huì)出現(xiàn)發(fā)酸、發(fā)黏、漲盒的情況，表明分離鑒定出的這幾種微生物是導(dǎo)致氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管冷藏條件下發(fā)生腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

3 結(jié) 論

在冷藏條件下，氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管中較高的水分含量和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致其在貯藏過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。氣調(diào)包裝采用的是密封性較好的材料，填充氣體為75%氮?dú)?25%二氧化碳，對(duì)食品中的好氧菌有較好的抑制作用。從pH值、感官特性等方面判斷，在貯藏過程中氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管的品質(zhì)變化是緩慢的，且在冷藏第8天時(shí)已完全不能食用。經(jīng)分離鑒定得到，特基拉芽孢桿菌、香坊腸桿菌、肉芽腫克雷伯氏菌和副黃假單胞菌是氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管中的主要腐敗菌。本研究結(jié)果對(duì)今后研究氣調(diào)包裝醬鹵鴨食管防腐工藝中抑菌劑及滅菌工藝的選擇均有參考意義。

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