高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對動物源食品中阿莫西林藥物殘留的檢測

吳 斌，李 晶

(1.馬鞍山市食品藥品執(zhí)法支隊(duì)，安徽馬鞍山 243000;2.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院食品系，山東威海 264210)

阿莫西林(Amoxicillin)，又名安莫西林或安默西林，學(xué)名稱為羥氨芐青霉素，屬于青霉素類β－內(nèi)酰胺抗生素，為半合成的耐酸廣譜青霉素類抗菌素，對金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、胸膜炎放線桿菌等幾種常見的重要致病菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性，目前廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床［1］。阿莫西林的不當(dāng)或過量使用都會造成其在動物性食品中的殘留，食用后會導(dǎo)致人體內(nèi)白血球降低，影響內(nèi)臟功能，發(fā)生臟器損害等，對老人、兒童，特別是胎兒的影響更大，嚴(yán)重者會導(dǎo)致胎兒病變、畸形、流產(chǎn)、死亡［2］。2012年底我國出現(xiàn)的速成雞事件中，使用的獸藥中就包括阿莫西林，因此很多國家和地區(qū)都對阿莫西林殘留量有嚴(yán)格的要求，是歐盟和北美等國家對進(jìn)口動物性食品的必檢項(xiàng)目之一。歐盟要求在動物的肌肉、肝、腎、脂肪中的阿莫西林的最高限量為0.05 mg/kg，美國要求0.01 mg/kg，日本要求 0.02 mg/kg。

目前報(bào)道的阿莫西林殘留分析的方法主要有液相色譜法［3］、免疫分析法［4］、微生物測定法［5］、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法［6］。近年來，隨著液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)技術(shù)的發(fā)展，其不僅具有液相色譜的高分離性能，而且能提供藥物結(jié)構(gòu)方面的信息，可以進(jìn)行確證檢測，在藥物殘留分析領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用，因此筆者選擇用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法分析阿莫西林殘留。

目前關(guān)于阿莫西林樣品前處理方法報(bào)道很多，但是在實(shí)際應(yīng)用方面存在很多缺點(diǎn)，從一些企業(yè)內(nèi)部的檢測中心和第三方檢測機(jī)構(gòu)了解到，目前報(bào)道的關(guān)于雞肉產(chǎn)品中阿莫西林的檢測方法不能很好地在實(shí)際中使用。比如有報(bào)道方法［2，7］，采用75 mg/L 的三氯乙酸進(jìn)行除蛋白;我國國標(biāo)方法［8］直接用磷酸鹽緩沖液提取，不進(jìn)行除蛋白，直接進(jìn)行SPE凈化。但現(xiàn)在養(yǎng)殖場都是大規(guī)模飼養(yǎng)，雞的出欄周期很短，肌肉纖維少，用緩沖液提取后，成膠狀，即使采用75 mg/L的三氯乙酸處理也不能有效去除蛋白，離心效果差，過SPE柱極其困難，無法操作。而且現(xiàn)在很多出口企業(yè)出口成品，即經(jīng)過加熱處理的產(chǎn)品，有些可以直接食用，而目前報(bào)道的方法都是關(guān)于新鮮肉中阿莫西林的檢測，但在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)，生肉和熟肉中阿莫西林的前處理方法差異很大。因此，筆者采用LC－MS/MS法，前處理使用乙酸鋅除蛋白和脂肪，研究了豬肉和雞肉中阿莫西林殘留的檢測，建立一種分析豬肉和雞肉組織樣品中阿莫西林殘留量的有效方法。該方法具有簡便、快速、靈敏、試劑用量少等特點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料。雞肉、豬肉、雞肉成品和豬肉成品均采自于食品加工廠。成品是指已經(jīng)完成加工，可直接食用的食品。

1.1.2 主要試劑。阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，批號C 10242500)，德國Labor Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;乙睛(色譜純)，美國Fisher公司;甲醇(色譜純)，德國Merck公司;甲酸(純度≥98%)，瑞士 Fluka公司;水(色譜純)，美國Fisher公司;其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備。固相萃取柱(HLB 6 cc 500 mg)，美國Waters公司;HP 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;API 3200三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)［配有電噴霧離子化源(ESI)和 Analyst 1.4.2工作軟件］，美國 ABI公司;NR6891475型拍打式均質(zhì)器，北京陸橋技術(shù)有限公司;4K－15型離心機(jī)，美國Sigma公司;固相萃取裝置，美國 Waters公司。

1.2 溶液配制 磷酸鹽緩沖溶液:稱取18.0 g(NaH2PO4)，用水溶解并定容至1 L，然后用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5。阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品適量，用50%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液溶解并定容至50 ml，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封，－18℃保存。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 ml，用50%乙腈水溶液定容至10 ml，稀釋成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，－18℃下保存7 d。

流動相:由 A、B 2種溶液組成，A為乙腈;B為10 mmol/L的乙酸銨(含0.35%乙酸)。

1.3 測定方法

1.3.1 樣品處理。稱取(3.00±0.01)g勻質(zhì)樣品，置于均質(zhì)袋中，加入30 ml磷酸鹽緩沖溶液，均質(zhì)拍打5 min。對于雞肉樣品，加入1.0 ml 1 mol/L乙酸鋅溶液;對于雞肉成品和豬肉成品，加入0.5 ml 1 mol/L乙酸鋅溶液;豬肉樣品不加乙酸鋅溶液。繼續(xù)均質(zhì)拍打5 min，然后，以4 500 r/min離心10 min，得上清液，待凈化。

1.3.2 固相萃取凈化。依次用5 ml甲醇、5 ml水和5 ml磷酸鹽緩沖溶液活化HLB柱(6cc，500 mg)固相萃取柱。取上述組織提取液15 ml上樣，以3 ml/min的流速通過固相萃取柱后，用5 ml水洗柱，真空將萃取柱抽干，棄去全部流出液。用3 ml乙腈－0.005%甲酸(4∶6，V∶V)洗脫，收集洗脫液于5 ml刻度樣品管中，并用洗脫液定容至3 ml，搖勻后，過0.22 μm濾膜，稀釋10倍后，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 色譜條件。色譜柱:Waters XBridgeTMHILIC(2.0 mm× 150 mm i.d，3 μm);流動相由A、B 2種溶液組成:A相為乙腈，B相為10 mmol/L的乙酸銨(含0.35%乙酸)。梯度洗脫程序:0～1 min，90%A;1～3 min，90%A ～5%A;3～8 min，5%A;8 ～8.5 min，5%A ～90%A;8.5 ～ 20 min，90%A。流速:200 μl/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:10 μl。

質(zhì)譜參數(shù):電離模式ESI+;電離電壓5 500 V;氣簾氣流速(Curtain Gas)30 L/h;離子源溫度600℃;霧化氣流速(Gas1)80 L/h;輔助加熱氣流速(Gas2)80 L/h;MRM監(jiān)測阿莫西林離子對及對應(yīng)條件見表1。

表1 阿莫西林的HPLC-ESI MS/MS儀器參數(shù)

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取適量的1～20 μg/L各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1 ml，用乙腈 －0.005%甲酸(4∶6，V∶V)定容至1 ml，充分混勻，制得質(zhì)量濃度為10、20、50、100 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行HPLC－MS/MS分析。每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，取平均值繪制質(zhì)量濃度(C)—色譜峰面積(A)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 重復(fù)性和加標(biāo)回收試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取(3.00±0.01)g勻質(zhì)樣品，分別向其中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度分別為3.0、6.0、9.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液各 100 μl，使得空白組織中阿莫西林的添加量分別為100、200、300 ng/g，每個(gè)添加量設(shè)置4個(gè)平行，經(jīng)過“1.3.1”的方法提取凈化后，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，外標(biāo)法定量，計(jì)算添加回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 按“1.3.4”方法制備阿莫西林的標(biāo)準(zhǔn)溶液并上機(jī)測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在10～100 ng/ml的線性范圍內(nèi)，曲線線性良好，標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=914X+0.000 872，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7。阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

測定檢出限是采用添加法進(jìn)行實(shí)測情況確定的。在空白樣品中添加水平為30 ng/g時(shí)，信噪比(S/N)大于3，由此可以確定該方法阿莫西林的檢出限為30 ng/g。添加水平為100 ng/g，信噪比(S/N)大于10，因此方法定量限為100 ng/g?？瞻讟悠飞V圖見圖2。

2.2 提取溶液的選擇 關(guān)于阿莫西林殘留的檢測方法很多，目前國內(nèi)外關(guān)于阿莫西林的提取與凈化方法，其提取溶液一般為磷酸鹽緩沖溶液［7－9］、乙腈［10］、甲醇水溶液［11］。該試驗(yàn)在前期做了大量的預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用有機(jī)溶劑提取回收率偏低，且不穩(wěn)定，可能是由于阿莫西林在有機(jī)溶劑中的溶解度偏低的原因。另外，在去除有機(jī)溶劑的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹都會造成阿莫西林回收率降低。用帶有一定離子強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行提取，回收率均高于有機(jī)溶劑提取，這可能是由于阿莫西林在水溶液中容易發(fā)生二聚合作用和內(nèi)酰胺環(huán)的水解［7］，磷酸鹽緩沖溶液會阻止這一過程。

在用磷酸鹽緩沖溶液提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，雞肉樣品均質(zhì)后成膠狀，無法離心得到上清液，且過SPE柱極其困難，無法操作，而豬肉樣品可離心得到上清液。原因可能是現(xiàn)在的雞是養(yǎng)殖場大規(guī)模飼養(yǎng)，出欄周期短，在2012年出現(xiàn)的速成雞事件中，出欄周期僅為40 d左右，因此雞肉中肌肉纖維少，均質(zhì)后成膠狀，無固體殘留物，無法離心得到上清液，而通過改變磷酸鹽緩沖溶液的濃度和pH也不能改變這一情況。于桂陽［7］和劉媛等［2］通過加入75 mg/L三氯乙酸去除蛋白，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)75 mg/L三氯乙酸無法有效去除雞肉中蛋白，加大三氯乙酸的濃度可以去除蛋白，但是會造成阿莫西林的分解。乙酸鋅具有除脂和除蛋白的作用，因此該試驗(yàn)通過加入乙酸鋅發(fā)現(xiàn)可以有效地去除蛋白和脂肪。通過改變加入乙酸鋅的量，分別試驗(yàn)了加入1 mol/L的乙酸鋅的量為0、0.5、1.0、1.5、2.0 ml時(shí)，發(fā)現(xiàn)雞肉樣品通過加入1.0 ml 1 mol/L的乙酸鋅，雞肉成品和豬肉成品加入0.5 ml 1 mol/L的乙酸鋅，豬肉樣品不加乙酸鋅，阿莫西林的加標(biāo)回收率均大于75%。因?yàn)槌善肥羌訜岷蟮氖熘破?，加熱制作過程中可使大部分熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)變性，但同時(shí)會溶出一些熱穩(wěn)定的蛋白，所以豬肉成品的加標(biāo)回收率遠(yuǎn)低于豬肉樣品，需要通過加入0.5 ml 1 mol/L的乙酸鋅去除蛋白才能達(dá)到理想的回收率。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化 固相萃取柱具有一定的除脂和除蛋白的能力，具有良好的凈化作用，在殘留分析中廣泛使用，方法已經(jīng)很成熟。該試驗(yàn)使用Waters HLB柱，可以很好地保留阿莫西林。使用固相萃取柱凈化阿莫西林的一個(gè)難點(diǎn)在于洗脫液的處理，一般洗脫液要經(jīng)過濃縮和復(fù)溶才能上機(jī)檢測。該試驗(yàn)在前期試驗(yàn)中直接利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹濃縮標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)阿莫西林損失很大，因此考慮洗脫液直接上機(jī)檢測。

在質(zhì)譜分析中，定溶液對目標(biāo)分析物的峰形和靈敏度影響巨大，阿莫西林的定溶液中必須含有一定濃度的甲酸或乙酸才能獲得較好的峰形和靈敏度。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸的濃度較大會抑制阿莫西林的電離，采用0.005%的甲酸時(shí)，阿莫西林的靈敏度最大，因此該試驗(yàn)使用乙腈和0.005%甲酸的混合液優(yōu)化兩者之間的比例。試驗(yàn)考察了當(dāng)乙腈－0.005%甲酸的比例為 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7 時(shí)阿莫西林的峰形和靈敏度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈的比例逐漸降低時(shí)，阿莫西林的峰形和靈敏度都有較大改善。由于該試驗(yàn)使用的是固相萃取柱洗脫液直接上機(jī)檢測，乙腈濃度太低，會影響阿莫西林的洗脫效果。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈－0.005%甲酸的比例為4∶6時(shí)，阿莫西林的回收率大于90%，且色譜峰形和靈敏度都較好，因此選擇乙腈－0.005%甲酸的比例為4∶6。

2.4 色譜條件的選擇與優(yōu)化 阿莫西林屬于青霉素類藥物，在結(jié)構(gòu)上含有羧基、酚羥基和氨基，屬于極性較強(qiáng)的藥物。用普通的C18柱進(jìn)行分離，因容量因子小，出峰時(shí)間快，出峰時(shí)間稍大于死時(shí)間t0，所以抗雜質(zhì)干擾能力差。早期多采用陰離子交換柱來測定，近年來隨著色譜柱技術(shù)的發(fā)展，有些色譜柱通過內(nèi)嵌極性基團(tuán)或采用雜化鍵合技術(shù)，使一些反相色譜柱具有極性物質(zhì)分離的能力。

親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)是互補(bǔ)于反相的色譜技術(shù)，它可成功地提高對極性非常大的物質(zhì)的保留，同時(shí)還可以為極性物質(zhì)和可離子化物質(zhì)的混合物提高正交于反相的分離模式。HILIC通過采用高有機(jī)溶劑低水含量的流動相與極性固定相的組合，按親水性(極性)由小到大的順序梯度洗脫分析物，解決了極性物質(zhì)在反相色譜柱保留困難的問題。目前國內(nèi)外使用HILIC色譜柱分析阿莫西林還沒有見報(bào)道，考慮到阿莫西林的強(qiáng)極性，該試驗(yàn)研究了采用乙腈作為有機(jī)相，選擇HILIC色譜柱作為阿莫西林的分析柱。

乙腈因其質(zhì)子惰性(接受氫鍵)，乙腈的使用可加強(qiáng)分析物和固定相表面的極性吸附層之間的氫鍵結(jié)合作用，從而增加保留時(shí)間，因此該試驗(yàn)色譜流動相使用乙腈作為有機(jī)相。由于HILIC色譜柱固定相表面上的液層與阿莫西林的帶電溶質(zhì)之間存在離子相互作用，要得到充分的保留時(shí)間和良好的重現(xiàn)性，水相通常必須使用帶有一定離子強(qiáng)度的緩沖溶液?？紤]到該試驗(yàn)采用質(zhì)譜分析，流動相不能用難揮發(fā)性的鹽，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用10 mmol/L乙酸銨(含0.35%乙酸)，阿莫西林分離較好，色譜峰尖銳在優(yōu)化的色譜條件下，測得畜禽組織中阿莫西林保留時(shí)間約7.2 min，色譜峰峰形尖銳，且均為基線分離峰。空白組織提取液在上述保留時(shí)間無干擾峰出現(xiàn)，見圖2。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確稱取(3.00±0.01)g勻質(zhì)樣品，置于均質(zhì)袋中，加入不同量的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率與精密度見表2。

由表2可以看出，在不同的樣品組織和不同的加標(biāo)水平下，阿莫西林的回收率為75.42% ～90.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～9.8%，該方法靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度均滿足國家對禁用藥物殘留的檢測要求。

表2 阿莫西林加標(biāo)回收率(n=4)

3 結(jié)論

該試驗(yàn)首次研究了豬肉和雞肉成品中阿莫西林殘留的檢測，并首次使用HILIC柱成功分析了阿莫西林。樣品經(jīng)過磷酸鹽緩沖溶液提取、乙酸鋅沉淀蛋白、HLB固相萃取柱凈化、乙腈－0.005%甲酸洗脫后，直接上機(jī)檢測，其靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度都滿足國家對禁用藥物的要求。

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