高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿鹽酸偽麻黃堿濃度

霍曉奎　王長遠

摘要：目的 ?建立一種高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）測定人血漿鹽酸偽麻黃堿濃度的方法。方法 ?血漿樣品經(jīng)液液萃取后，以甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1，V/V/V）為流動相，流速0.35 ml/min，采用Cap cell pack C18色譜柱分離，150 mm×2.1 mm， ? ? 5 μm（USA）;柱溫20℃，選擇離子噴霧離子化源串聯(lián)質(zhì)譜，通過正離子方式檢測;選擇反應監(jiān)測（MRM）方式轉(zhuǎn)化m/z=166.3/148.2（鹽酸偽麻黃堿）和m/z= 152.2/134.15（內(nèi)標苯丙醇胺）進行定量分析，用內(nèi)標法測定含量。結(jié)果 ?偽麻黃堿濃度分別在5.0～400.0 ng/ml的范圍內(nèi)線性良好，R=0.9962，最低檢測限為1.0 g/ml。結(jié)論 ?本方法操作簡便、快速，結(jié)果準確，可用于該藥物的含量測定，同時也可為臨床藥動學研究提供一定的參考。

關鍵詞：偽麻黃堿;LC-MS/MS;血藥濃度;藥代動力學

中圖分類號：R969.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.054

文章編號：1006-1959（2019）19-0163-03

Determination of Pseudoephedrine Hydrochloride in Human Plasma by High Performance

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUO Xiao-kui，WANG Chang-yuan

（School of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116044，Liaoning，China）

Abstract：Objective ?To establish a high performance liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS/MS） method for the determination of pseudoephedrine hydrochloride in human plasma.Methods ?After the liquid sample was extracted by liquid-liquid extraction， the mobile phase was methanol：water：formic acid （60∶40∶1， V/V/V）， the flow rate was 0.35 ml/min， and separated by Cap cell pack C18 column， 150 mm×2.1mm，5 μm （USA）; column temperature 20°C， selective ion spray ionization source tandem mass spectrometry， positive ion detection; selective reaction monitoring （MRM） conversion m/z=166.3/148.2 （pseudoephedrine hydrochloride） and m/z=152.2/134.15 （internal standard phenylpropanolamine） for quantitative analysis， content determined by internal standard method.Results ?The pseudoephedrine concentration was linear in the range of 5.0～400.0 ng/ml，R=0.9962， and the minimum detection limit was 1.0 g/ml.Conclusion ?The method is simple， rapid and accurate， and can be used for the determination of the drug content. It can also provide a reference for clinical pharmacokinetic studies.

Key words：Pseudoephedrine;LC-MS/MS;Blood concentration;Pharmacokinetics

麻黃中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿成分為擬腎上腺類藥物，是國家規(guī)定的需要嚴格控制的毒、麻類成分，鹽酸偽麻黃堿有收縮上呼吸道血管的作用，可以用于鼻黏膜水腫的治療，配伍使用抗組胺藥，可用于過敏性鼻炎和感冒等的治療。建立鹽酸偽麻黃堿的含量測定方法具有重要的意義。目前鹽酸偽麻黃堿的含量測定以高效液相色譜法為主，但該法存在檢測靈敏度低，檢測時間長等缺點。本研究建立了一種高效液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用法測定鹽酸偽麻黃堿的含量，此方法簡便、易行，結(jié)果可靠、準確，可為鹽酸偽麻黃堿含量測定的質(zhì)量控制標準提供參考，同時也可為臨床藥動學研究提供一定的參考，現(xiàn)介紹如下。

1儀器與試藥

1.1儀器 ?Agilent 1200液相色譜儀，Applied Biosystems公司API3200型質(zhì)譜儀，德國FLOM公司FCR 2002-UF型純水機，德國Thermo公司ST-16R型高速離心機。

1.2試藥 ?鹽酸偽麻黃堿對照品，由中國生物制品檢驗鑒定所提供，含量99.8%;苯丙醇胺對照品（內(nèi)標物，含量99.8%，100217-200303），由中國生物制品檢驗鑒定所提供，甲醇為色譜純，購自Fisher試劑公司。其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜條件 ?色譜柱為Cap cell pack C18，150 mm×2.1 mm，5 μm（USA）;流動相為甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1，V/V/V）;流速為0.35 ml/min;柱溫為20℃。離子源為ESI源;噴射電壓（IS）5.5 kV;溫度（TEM）650;鞘氣（N2）流量（GAS 1）40 psi;輔助氣（N2）流量（GAS 2）35 psi;氣簾氣（CUR）10 psi;去簇電壓（DP）26 eV（鹽酸偽麻黃堿）和26 eV（內(nèi)標）;碰撞電壓CE17 eV（鹽酸偽麻黃堿）和17 eV（內(nèi)標）;正離子方式檢測：掃描方式為多反應監(jiān)測MRM，選擇的離子反應m/z=166.3/148.2（鹽酸偽麻黃堿）和m/z=152.2/134.15（內(nèi)標苯丙醇胺）進行定量分析，一次進樣，雙通道檢測。

2.2溶液的制備 ?精密稱取對照品（鹽酸偽麻黃堿）5.0 mg和內(nèi)標（苯丙醇胺）對照品3.0 mg，分別置于250 ml量瓶中，加水∶甲醇（50∶50，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻后得到母液。實驗前用甲醇水稀釋成所需標準溶液。

2.3血漿樣品處理 ?取血漿0.5 ml，置10 ml具塞試管中，依次加入水100 μl，內(nèi)標溶液（400 ng/ml苯丙醇胺水溶液）100 μl，2 mol/L NaOH 溶液100 μl。渦流30 s。加提取溶劑甲基叔丁基醚3 ml，渦流15 s，往復震蕩10 min，3000 r/min離心10 min。分取上層有機相2 ml于40℃水浴中空氣流下吹干，殘留物加200 μl流動相溶解，取20 μl進樣。

2.4方法專屬性 ?在上述方法條件下，待測組分無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，待測物與內(nèi)標峰形良好，鹽酸偽麻黃堿與苯丙醇胺的保留時間分別為1.29 min和1.25 min，色譜圖見圖1。

2.5標準曲線與定量下限 ?在空白血漿中加入鹽酸偽麻黃堿標準溶液，配置成濃度為5.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 ng/ml的標準曲線用血漿樣品，按“2.3”中方法制備標準曲線。以濃度為橫坐標，以峰面積比值為縱坐標，用Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件，用加權最小二乘法進行回歸計算，求得標準曲線的回歸方程：y=0.0273x+0.0398（r=0.9962）（n=3）。線性范圍：根據(jù)標準曲線，鹽酸偽麻黃堿在5.0～400.0 ng/ml的范圍內(nèi)線性良好，定量下限為1.0 g/ml。

2.6方法回收率及精密度 ?按“標準曲線的制備”操作，制備鹽酸偽麻黃堿次低、中、次高三個濃度（分別為10、40、200 ng/ml）的樣品，5個樣本，分別在同一天內(nèi)測定5次和每天一次測定5天，計算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

3討論

鹽酸偽麻黃堿作為復方成分廣泛用于感冒藥中，用于減輕感冒癥狀。由于添加劑量一般較小，在人體內(nèi)濃度較低。偽麻黃堿的血藥濃度測定方法有很多種，尤其以高效液相色譜法較常見，但該法測定難度極大，分析時間長，并且靈敏度不高。隨著質(zhì)譜技術的發(fā)展， LC-MS/MS技術在血藥濃度的測定中被廣泛應用。在流速的考察中，選擇0.2 ml/min、0.35 ml/min、0.5 ml/min等多個流速對鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.35 ml/min峰型最好，故最終流速選擇0.35 ml/min;在檢測模式的選擇上，本研究分別考察了正離子和負離子的檢測方式，發(fā)現(xiàn)正離子檢測方式的靈敏度明顯高于負離子的檢測方式，因此選擇了正離子模式;在樣品處理環(huán)節(jié)中，考察了蛋白沉淀法和固相萃取法，結(jié)果顯示蛋白沉淀法存在基質(zhì)效應，影響測定的靈敏度和準確度，固相萃取法因提取回收率過低和價格高的原因被放棄，最終選擇液液萃取的方法。

本研究采用LC-MS/MS測定人血漿鹽酸偽麻黃堿的濃度，并采用液液萃取的方法處理樣品。成功的凈化了基質(zhì)，排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，且分析快速、靈敏度高、專屬性強。日內(nèi)、日間精密度及回收率等相關實驗數(shù)據(jù)均符合國家標準。該測定血漿中的鹽酸偽麻黃堿的方法符合有關規(guī)范要求，可用于藥物代謝動力學試驗。

參考文獻：

[1]木合塔爾·吐爾洪，楚剛輝，木尼熱·阿不都克里木.新疆戈壁野生木賊麻黃中麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量的測定[J].南開大學學報（自然科學版），2016，49（5）：74-78.

[2]黃韻然，王曉玲，謝志宏，等.鹽酸偽麻黃堿/鹽酸非索非那定復方緩釋膠囊的研究.Ⅱ.質(zhì)量研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47（4）：448-453.

[3]曹燕妮，李傳勛，呂佳，等.HPLC法測定咳喘寧口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017（21）：22-25.

[4]邱燕.HPLC法測定防風通圣顆粒中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量[J].海峽藥學，2018（1）：75-77.

[5]王博，孟鄉(xiāng)，孟繁蘊，等.膠束毛細管電泳法同時測定小青龍顆粒中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿與芍藥苷含量[J].中國藥房，2019（1）：45-49.

[6]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：890-892.

[7]鞏長芹，周利章.反相高效液相色譜法測定黃龍止咳顆粒中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2014（3）：225-227.