超聲波輔助酶法提取沙棘果油及其體外抗氧化能力分析

劉 儉 蔡永國 張 兵 歐陽韶 楊海燕，3

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院1，烏魯木齊 830052) (新疆慧華沙棘生物科技有限公司2，阿勒泰 836200) (新疆沙棘工程技術(shù)研究中心3，烏魯木齊 830000)

沙棘(HippopherhamnoidsL.)為胡頹子科沙棘屬灌木，又名醋柳、黑刺等[1]，廣泛分布于歐亞的溫帶地區(qū)[2]。我國沙棘資源豐富，總面積達3000萬畝[3]，占世界沙棘總面積的95%，且以肋果沙棘和中國沙棘亞種分布居多[4]。沙棘鮮果富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、黃酮類化合物及不飽和脂肪酸等[5]，沙棘果油(本研究僅指鮮果果油)是沙棘果實天然生物活性成分的精華，具有抗輻射、抗衰老、抗?jié)?、降血脂和增強免疫力等藥理功效[6]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[7]。

目前直接從沙棘鮮果中提取沙棘果油的方法主要有酶法[8]、壓榨離心法[9]和有機溶劑萃取法[10]等。與傳統(tǒng)提油工藝相比，酶法提油條件溫和，能夠最大限度保留活性成分，且其所需設(shè)備簡單，滿足食用油脂生產(chǎn)“安全、高效、營養(yǎng)、綠色”的原則[11]。UAE提取技術(shù)在近年來發(fā)展迅速，張妍[12]等提取菜籽油，發(fā)現(xiàn)UAE提取油脂得率可達67.55%，明顯優(yōu)于單一酶法提取。超聲波在液體中可以產(chǎn)生機械效應(yīng)、空化作用以及熱效應(yīng)等[13]，破壞細(xì)胞壁，進而暴露更多的酶促位點[14]，與酶法結(jié)合進行酶解反應(yīng)，能夠極大地縮短酶法提取時間和提高產(chǎn)品得率。有關(guān)UAE提油的研究較多，張偉光[15]等采用超聲波輔助蛋白酶法提取冬瓜籽油，在最優(yōu)條件下冬瓜籽油的提取率可達82.55%，比優(yōu)化前高10.06%；徐君飛等[16]從茶葉籽中提油，發(fā)現(xiàn)UAE提取工藝在最佳條件下，茶葉籽出油率為(52.61±0.11)%。

顧晶晶[17]采用超聲波預(yù)處理沙棘原漿，超聲功率200 W、超聲時間10 min，然后加入酶制劑進行酶解提油，發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理對酶法提取沙棘果油沒有幫助。然而關(guān)于UAE提取沙棘果油鮮有報道，本研究基于此出發(fā)點以沙棘鮮果為原料，采用UAE提取沙棘果油。首先在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶制劑的比例，然后利用單因素與正交試驗對沙棘果油的提取工藝進行優(yōu)化，旨在降低沙棘果油的提取成本和提高果油得率；同時運用GC對沙棘果油的脂肪酸組成進行分析，并測定沙棘果油的體外抗氧化能力，以期為UAE提取高品質(zhì)的沙棘果油的工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

沙棘鮮果：2017年10月采摘于新疆青河縣，-18 ℃低溫凍存至6月份實驗；果膠酶：最適pH 3.5～4.0，最適溫度50 ℃，酶活力500 U/mg；纖維素酶：pH 4.8～5.0，50 ℃，酶活力≥50 U/mg；酸性蛋白酶：pH 2.5～4.0，40～50 ℃，酶活力≥50 U/mg。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TC-1056破壁養(yǎng)生調(diào)理專家；TDL-5-A低速大容量離心機；5417R小型臺式冷凍型離心機；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器；SZF-06A脂肪測定儀；GC-2014氣相色譜儀；UV-1200紫外可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘果油提取工藝流程

沙棘凍果→解凍(水溫60 ℃、時間1 min)→打漿過濾→沙棘原漿→調(diào)節(jié)pH→超聲酶解→離心分離(4 000 r/min離心20 min)→上層果油粗品→二次離心(8 000 r/min離心10 min )→沙棘果油

1.2.2 沙棘原漿基本指標(biāo)的測定

水分的測定：GB 5009.3—2016直接干燥法；可溶性固形物：使用PAL-1數(shù)字手持袖珍折射儀進行測定，結(jié)果以°Brix計；pH：使用PHS-3C PH計進行測定；粗脂肪的測定：GB 5009.6—2016索氏抽提法；粗蛋白的測定：GB 5009.5—2016凱氏定氮法；總酸：GB/T 12456—2008酸堿滴定法，結(jié)果以蘋果酸計(沙棘原漿主要的有機酸之一[18])。

1.2.3 沙棘果油得油率計算

沙棘果油得油率和提取率的計算公式：

(1)

式中：m為果油質(zhì)量/g；M為沙棘原漿的質(zhì)量/g。

(2)

式中:W為沙棘原漿粗脂肪含量。

1.2.4 復(fù)合酶制劑比例的篩選

1.2.4.1 單一酶添加量的單因素試驗

選擇果膠酶、纖維素酶、酸性蛋白酶添加量進行單因素試驗，固定酶解時間4 h、超聲功率150 W，考察三種酶在其最適酶解環(huán)境下，添加量梯度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)%對沙棘果油得油率的影響。

1.2.4.2 復(fù)合酶制劑比例的優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，設(shè)置酶解的條件為：超聲功率150 W、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃和pH 4.0。選取果膠酶添加量(A)，纖維素酶添加量(B)，酸性蛋白酶添加量(C)作為試驗因素，以沙棘果油得油率(Y)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 10.0.3軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，優(yōu)化復(fù)合酶制劑比例，試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗的因素與水平

1.2.5 提取工藝的優(yōu)化

1.2.5.1 單因素試驗

采用單因素試驗，考察不同的超聲功率(100、125、150、175、200)W、超聲酶解時間(2、3、4、5、6)h、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)和復(fù)合酶總添加量(0.6、0.9、1.2、1.5、1.8)%對沙棘果油得油率的影響。

1.2.5.2 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取超聲功率、超聲酶解時間、pH和復(fù)合酶總添加量一共4個因素，按照L9(34)的正交表進行正交試驗。探究UAE提取沙棘果油工藝優(yōu)化的參數(shù)。

表2 正交試驗的因素與水平

1.2.6 GC分析沙棘果油脂肪酸組成

根據(jù)GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》中第三法歸一化法進行測定[19]。

1.2.7 沙棘果油活性成分的測定

黃酮：參照Sharif等[20]方法進行測定；維生素E：參照Cenkowski等[21]的方法進行測定；類胡蘿卜素：參照楊萬政等[22]的方法進行測定。

1.2.8 沙棘果油體外抗氧化能力的測定

·OH清除能力的測定：參照Hifney等[23]的方法進行測定。ABTS+·清除能力的測定：參照Li等[24]的方法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析使用Excel和SPSS 21.0軟件，作圖采用Origin 8.5軟件，使用Design-Expert 10.0.3軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面分析和Taguchi OA試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分

2.1 沙棘原漿的主要成分

對制得的沙棘原漿立即進行理化指標(biāo)的測定，其測定結(jié)果見表3。

表3 沙棘原漿的主要成分

2.2 復(fù)合酶制劑比例的確定

2.2.1 單一酶添加量的單因素試驗結(jié)果

圖1 單一酶添加量對沙棘果油得油率的影響

2.2.2 復(fù)合酶制劑比例的優(yōu)化試驗結(jié)果

基于單因素試驗，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)合酶制劑的比例，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗。具體試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表5 Box-Behnken試驗結(jié)果二次回歸方差分析

注：P<0.01，極顯著(**)；P<0.05，顯著(*)。

2.3 UAE提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗結(jié)果

圖2 不同因素對沙棘果油得油率的影響

由圖2可知，在酶法提取沙棘果油的過程中施加超聲波，當(dāng)超聲功率為100～125 W時，得油率不斷升高，在超聲功率125 W時達到最高。這是因為超聲波的機械振動和空化作用能夠破壞細(xì)胞組織，促進胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，酶解與之結(jié)合能夠大大提高果油得率[27]。當(dāng)超聲功率大于125 W時，沙棘果油得率開始下降；當(dāng)超聲功率在200 W時，甚至低于對照組(0 W)，這與較高的超聲功率導(dǎo)致酶活降低或部分喪失有關(guān)[28]。隨著超聲酶解時間的延長，沙棘果油得率不斷提高，在超聲酶解時間2～3 h時，得油率上升幅度較大，當(dāng)時間超過3 h后，得油率基本保持不變。這是由于酶解效率隨著時間的延長逐漸提高，油脂釋放就會越多，但是繼續(xù)延長時間，酶解反應(yīng)會因為底物減少以及產(chǎn)物增多而受到抑制。隨著pH升高，沙棘果油得油率先增加后減小，當(dāng)pH為3.5時，得油率最高為3.424%。這是因為酶不在最適pH條件下，其活性會受到抑制，導(dǎo)致得油率下降。當(dāng)復(fù)合酶總添加量為0.6～1.2%時，沙棘果油得率隨著酶添加量的增多不斷升高，繼續(xù)增加復(fù)合酶總添加量，得油率變化不大。

2.3.2 工藝的優(yōu)化試驗結(jié)果

由表6可知，正交試驗結(jié)果最優(yōu)組合為2號(X1-1X2-2X3-2X4-2)，得油率為3.465%，各因素對沙棘果油得油率的影響主次順序為X4(復(fù)合酶添加量)>X1(超聲功率)>X3(pH)>X2(超聲酶解時間)，最優(yōu)工藝的水平組合為X1-2X2-2X3-2X4-2。對其進行驗證試驗，沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%，優(yōu)于正交試驗2號。因此選擇X1-2X2-2X3-2X4-2作為UAE提取沙棘果油的最佳工藝，即超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復(fù)合酶添加量1.2%，超聲酶解溫度50 ℃，在此工藝下的沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%，提取率為83.9%。

表6 正交試驗結(jié)果

2.4 沙棘果油的脂肪酸組成及其活性成分分析

2.4.1 脂肪酸組成分析

據(jù)查國立北平師范大學(xué)始建于1902年京師大學(xué)堂(師范館)，后經(jīng)多次大學(xué)演變于1931年7月北平師范大學(xué)與北平女子師范大學(xué)合并，定名國立北平師范大學(xué)。1932年經(jīng)教育部正式批準(zhǔn)改為國立北平師范大學(xué)。1937年7月，盧溝橋事變后，北平師范大學(xué)遷往西安，與國立北平大學(xué)、國立北洋工學(xué)院組成西安臨時大學(xué)。1938年春，西安臨時大學(xué)遷至漢中，改名為國立西北聯(lián)合大學(xué)，北平師大改為西北聯(lián)大教育學(xué)院。同年8月，西北聯(lián)合大學(xué)教育學(xué)院改為師范學(xué)院，后改稱國立西北師范學(xué)院。

采用GC分析UAE提取的沙棘果油脂肪酸組成，由表7可知，沙棘果油的脂肪酸被檢測出13種，主要脂肪酸為棕櫚酸、棕櫚油酸和亞油酸。不飽和脂肪酸共有6種，含量高達60.596 1%，分別為棕櫚油酸、順-10-十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸和神經(jīng)酸，其中棕櫚油酸含量達到43.389 9%，亞油酸含量為11.266 5%。棕櫚油酸具有降低血脂，預(yù)防動脈硬化和緩解糖尿病、脂肪肝等慢性疾病的功效[29]；亞油酸是人體必需脂肪酸，具有增強機體免疫能力，防治動脈粥樣硬化和老年性肥胖癥等功效[30]，由此可知沙棘果油具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。

表7 沙棘果油的脂肪酸組成與相對含量

2.4.2 活性成分分析

表8可見，采用UAE提取的沙棘果油含大量活性成分，其黃酮含量為(62.88±0.26) mg/100 g，維生素E含量為(150.35±0.08) mg/100 g，類胡蘿卜素含量為(14.66±0.32) mg/100 g。

表8 沙棘果油的活性成分

2.5 沙棘果油體外抗氧化能力研究

2.5.1 沙棘果油清除·OH能力

圖3 對·OH的清除率

羥自由基廣泛存在于生物體內(nèi)，是一種細(xì)胞毒性很強的自由基，能使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)出現(xiàn)損傷，從而引發(fā)各種疾病和機體衰老，且其反應(yīng)極快[31]。由圖3可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，沙棘果油和VC清除·OH的能力幾乎呈線性上升，其清除·OH的IC50分別為179.33 μg/mL和122.62 μg/mL，VC的·OH清除能力是沙棘果油的1.46倍。結(jié)果表明，沙棘果油清除·OH的能力較強，略弱于VC。

2.5.2 沙棘果油清除ABTS+·能力

由圖4可知，在質(zhì)量濃度為4～12 mg/mL時，沙棘果油的ABTS+·清除能力呈現(xiàn)線性上升的趨勢，由41.26%～95.25%，之后趨于平緩。VC對ABTS+·的清除能力基本維持在99%左右，表明質(zhì)量濃度為12 mg/mL的沙棘果油與VC的ABTS+·清除能力相近。沙棘果油對ABTS+·清除作用的IC50=5.54 mg/mL。

圖4 對ABTS+·的清除率

3 討論

通過測定UAE提取的沙棘果油脂肪酸組成、活性成分及其體外抗氧化能力，結(jié)果證明沙棘果油富含不飽和脂肪酸，是一種營養(yǎng)價值極高的植物油脂，同時具有較強的抗氧化能力。目前直接從沙棘鮮果中提取沙棘果油的方法主要有酶法、壓榨離心法和有機溶劑萃取法等。李煒等[9]采用壓榨離心法提取沙棘果油，溫度60 ℃、8 000 r/min離心10 min，工藝簡單但是得油率不足1%，提取率為35.6%。采用UAE提取沙棘果油，超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復(fù)合酶添加量1.2%，超聲酶解溫度50 ℃，在該條件下的沙棘果油得油率可達3.5%，提取率為83.9%。沙棘果實的細(xì)胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素等物質(zhì)組成[32]，沙棘果油在果實兩端和細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，以脂蛋白、脂多糖等形式存在[33]。選擇果膠酶、纖維素酶和酸性蛋白酶復(fù)配，能使細(xì)胞壁與胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)酶解更加徹底，提高沙棘果油的得油率。酶法提油反應(yīng)條件溫和，結(jié)合超聲波輔助處理可以大大減少酶解時間，本實驗中，超聲酶解時間3 h，較康健等[32]縮短50%，較汪曉琳[34]縮短29.2%，最大限度地保持了沙棘原漿風(fēng)味和保留沙棘天然活性成分。沙棘原漿經(jīng)UAE提取沙棘果油后，采用液體超微化粉粹、超高壓均質(zhì)勻漿、脫氣和殺菌灌裝將果漿加工成沙棘濁汁[35]，此種方法能夠增加單位原料價值，為企業(yè)經(jīng)濟效益的提高提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

采用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗對復(fù)合酶的比例進行優(yōu)化，得到最優(yōu)添加量比例為果膠酶∶纖維素酶∶酸性蛋白酶=0.675%∶0.424%∶0.508%。通過單因素與正交試驗對沙棘果油的UAE提取工藝進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)的工藝為超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復(fù)合酶添加量1.2%，超聲酶解溫度50 ℃，該條件下沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%，提取率為83.9%。運用GC對沙棘果油的脂肪酸組成進行分析，沙棘果油的脂肪酸被檢測出13種，主要為棕櫚酸、棕櫚油酸和亞油酸。不飽和脂肪酸共有6種，含量高達60.596 1%，分別為棕櫚油酸、順-10-十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸和神經(jīng)酸，其中棕櫚油酸含量達到43.389 9%，亞油酸含量為11.266 5%。沙棘果油的黃酮含量為(62.88±0.26)mg/100 g，維生素E含量為(150.35±0.08)mg/100 g，類胡蘿卜素含量為(14.66±0.32) mg/100 g。同時，體外抗氧化能力的測定結(jié)果表明沙棘果油具有較強的體外抗氧化能力。