固原地區(qū)雞輸卵管炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

安慧慧

（固原市原州區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏 固原 756000）

產(chǎn)蛋雞輸卵管炎是蛋雞常見的繁殖障礙疾病，主要經(jīng)呼吸道、消化道感染,臨床上主要表現(xiàn)為蛋雞無產(chǎn)蛋高峰,產(chǎn)畸形蛋、軟殼蛋、血絲蛋和薄殼蛋等[1]，引起輸卵管炎的原因主要是因為雞舍衛(wèi)生條件太差，泄殖腔被細菌（如白痢沙門氏菌、大腸桿菌等）污染而侵入輸卵管導(dǎo)致雞死于輸卵管炎和腹膜炎。近幾年，隨著養(yǎng)雞業(yè)的不斷發(fā)展，飼養(yǎng)規(guī)模的擴大，禽大腸桿菌病已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。對該病進行有效的防控對養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展至關(guān)重要，而抗菌藥物的合理與有效使用是控制與防治[2]該病的重要環(huán)節(jié)。

由于家禽養(yǎng)殖者不科學(xué)使用抗生素，導(dǎo)致大腸桿菌病耐藥性不斷增加，防治難度越來越大[3]，為了有效防治本病，必須定期了解其對各種抗菌藥物的敏感程度，以指導(dǎo)臨床抗菌藥物的合理使用。本試驗通過臨床癥狀，尸體剖檢初步診斷為慢性輸卵管炎，經(jīng)微生物學(xué)檢查診斷為致病性大腸桿菌。同時對輸卵管炎病例進行病原菌的分離鑒定，并用12種常用抗菌藥物對分離出的致病性菌株做進一步的藥物敏感性試驗，篩選出比較敏感的藥物，為臨床防治雞輸卵管炎提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 試驗病料及供試動物

在寧夏固原某養(yǎng)雞場兩棟雞舍中采集病料，剖解檢查7只有輸卵管炎的病死雞，無菌采集輸卵管病料，標記清楚，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)以備用，共采集病料7份。7日齡雛雞32只。

1.2 主要儀器設(shè)備

XSP-3C生物顯微鏡（上海長方光學(xué)儀器有限公司）、DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海鴻都電子科技有限公司）、DNG-9030電熱恒溫干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）、JP-500托盤天平（上海新諾儀器設(shè)備有限公司）、280A高壓蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）等設(shè)備。

1.3 試驗試劑及藥物

革蘭氏染色液（ABCD）天津傲然精細化工研究所；麥康凱瓊脂購自北京奧星生物技術(shù)有限公司；普通營養(yǎng)瓊脂購自北京奧星生物技術(shù)有限公司；三糖鐵瓊脂購自北京三藥科技開發(fā)公司；LB培養(yǎng)基購自北京奧星生物技術(shù)有限公司。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、枸櫞酸鹽、M.R試劑、V-P試劑、硝酸鹽試劑等。

鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氯霉素、土霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、四環(huán)素、頭孢哌肟、培氟沙星、慶大霉素、頭孢哌酮，均購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

按成品營養(yǎng)瓊脂、麥康凱、三糖鐵、LB培養(yǎng)基的說明書正確稱取原料，按照配方配置培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌20 min，將滅菌的營養(yǎng)瓊脂，麥康凱培養(yǎng)基趁熱倒入已滅菌好的培養(yǎng)皿中，每個皿中倒15～20 ml，將分裝好的培養(yǎng)基放在無菌臺上過夜，第二天包裹并做標記。將三糖鐵趁熱分裝入試管，10～15 ml/支，完成時傾斜15～20°，第二天放于試管架上并標記。用吸管吸取LB溶液于小試管中，5 ml/支，放于試管架上并標記，將以上標記好的培養(yǎng)基放入4℃冰箱備用。

2.2 病原菌的分離提純

將有細菌生長的LB液用接種環(huán)接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，加蓋標記，倒放于恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況，然后挑取營養(yǎng)瓊脂上的單個菌落在營養(yǎng)瓊脂上進一步純化。

2.3 病原菌的鑒定

染色鏡檢：選擇干凈的載玻片，用移液器吸一滴生理鹽水于載玻片上，用滅菌的接種棒挑營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)基上單個菌落少許于生理鹽水上，均勻涂布，自然干燥后用火焰固定，進行染色。吸取草酸銨結(jié)晶紫溶液進行染色，作用1～2 min水洗；吸取革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1～3 min水洗；吸取95%酒精于抹片上脫色，約0.5～1 min水洗；吸取稀釋的石炭酸復(fù)紅染10～30 s水洗，染完后自然干燥，鏡檢。挑取分離純化的單個菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

麥康凱培養(yǎng)基：將提純的大腸桿菌單個菌落挑起，用滅菌的接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)基上菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基上，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后觀察。

三糖鐵培養(yǎng)基：將提純的大腸桿菌接種在三糖鐵瓊脂斜面，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后觀察。

2.4 生化試驗

對分離菌株進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、M.R、V-P、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原試驗9項生化指標的測定。

2.5 致病力試驗

將供試動物隨機分成8組，把分離鑒定的菌株接種到LB培養(yǎng)基上，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h。實驗組以0.2 ml/只頸背部皮下注射LB有菌液，對照組4只注射相同劑量的滅菌生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。剖檢病死雛雞，觀察其病理變化，并無菌采取死亡雛雞的肝臟，接種麥康凱平板分離培養(yǎng)細菌、涂片、染色鏡檢、生化反應(yīng)，鑒定是否與分離菌相同。

2.6 藥敏試驗

將鑒定為大腸桿菌的純培養(yǎng)基上的單個菌落接種于LB培養(yǎng)基中，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h。在無菌臺上，取LB培養(yǎng)基搖勻，將LB中的有菌培養(yǎng)液用吸管吸取5 ml，均勻的散布在營養(yǎng)瓊脂表面，將多余的有菌液吸取棄去。用鑷子取藥敏片貼到培養(yǎng)基表面，然后在培養(yǎng)基上劃一個箭頭，箭頭所指的方向為開頭，順次貼藥敏片，貼完后蓋上蓋子，做好相應(yīng)的標記。將貼好藥敏片的培養(yǎng)基倒放在恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后觀察，用直尺測抑菌圈的直徑并記錄（見表1）。

3 結(jié)果與分析

3.1 細菌培養(yǎng)特性

在LB培養(yǎng)基中呈均勻渾濁。營養(yǎng)瓊脂上菌落呈圓形隆起、表面光滑、濕潤、半透明、乳白色。麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈圓形凸起，表面光滑、濕潤、邊緣整齊，粉紅色。三糖鐵培養(yǎng)基的斜面和底層均為黃色，底部有氣泡產(chǎn)生。

表1 藥敏片抑菌圈判斷標準

3.2 細菌形態(tài)學(xué)檢查

病料涂片鏡檢可見，被檢菌為兩端鈍圓的陰性短桿菌，多數(shù)散在排列，偶有2～3個連在一起。純培養(yǎng)物革蘭氏染色鏡檢可見，培養(yǎng)物為革蘭氏陰性中等大小的直桿菌，兩端頓圓，單個或成對分布。通過純培養(yǎng)，分離到大腸桿菌7株。

3.3 生化試驗結(jié)果

生化試驗結(jié)果如表2所示。

表2 生化試驗結(jié)果

由表2可知，分離的7株細菌都能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，對MR試驗為陽性，V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性，硝酸鹽還原實驗為陽性。綜合以上實驗結(jié)果，可確定分離的7株菌為大腸桿菌。

3.4 致病力試驗結(jié)果

接種12 h后出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，羽毛松亂等臨床癥狀，接種24～48 h除2株分離菌未造成雛雞死亡，其余5株分離菌均造成雛雞大于2/3死亡，病死雞剖檢的病理變化、涂片、染色鏡檢、生化反應(yīng)與上述分離菌相同，對照組正常生長，因此在7株分離菌中可確定5株為致病性菌株。

3.5 藥敏試驗結(jié)果

5株致病性大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果如表3所示。

表3 5株致病性大腸桿菌對12種抗菌藥物的耐藥率

由表3可知：分離鑒定的5株致病性大腸桿菌中有4株對恩諾沙星敏感，敏感率達80%，有3株對卡那霉素和頭孢吡肟敏感，敏感率為60%，對其余9種抗菌藥物都有不同程度的耐藥性，其中對氟苯尼考、四環(huán)素、土霉素的耐藥率最高，達80%，其次是對鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、頭孢哌酮，耐藥率達60%，對環(huán)丙沙星、培氟沙星的耐藥率為20%。

4 討論

引起雞發(fā)生大腸桿菌病的因素眾多，雞群體內(nèi)有潛在的致病性大腸桿菌[4]，或與其它病原合并感染，或繼發(fā)于其它雞病等。本試驗所選養(yǎng)雞場而言，引起雞發(fā)生輸卵管炎性大腸桿菌的主要原因是飼養(yǎng)管理不當，雞舍內(nèi)衛(wèi)生狀況較差，通風(fēng)不良，氨氣濃度高，消毒措施不嚴格，飼喂了發(fā)霉變質(zhì)的飼料，雞群受到強應(yīng)激而導(dǎo)致機體抵抗力下降，環(huán)境中的大腸桿菌乘虛侵入雞群體內(nèi)引起大腸桿菌病的發(fā)生。為了降低雞大腸桿菌病發(fā)病機率，應(yīng)做好日常飼養(yǎng)管理工作。首先要制定嚴格的消毒措施；其次不能飼喂變質(zhì)的飼料，飲水要清潔；做好雞舍通風(fēng)和保暖，保持雞舍清潔干凈[5]，降低雞舍空氣中氨氣和粉塵含量，控制雞群密度，減少應(yīng)激；最后在臨床用藥方面要注意盡量避免長期大量使用同一種藥物，以免產(chǎn)生耐藥性，還應(yīng)考慮采取聯(lián)合用藥、交叉或輪換用藥等方法，才能有效防治大腸桿菌病。