一種雞肉中四環(huán)素類獸藥殘留高效液相色譜檢測方法的建立

王余磊，舒相華，張 雪，高云梅，楊 崑，張雅靖，呂 濤，宋春蓮

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201）

近年來，抗生素在醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用所導(dǎo)致的環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重。每年我國生產(chǎn)的21萬t的抗生素中9.7萬t的抗生素都流向了畜禽養(yǎng)殖場，大約占到了年產(chǎn)量的46.1%，而這巨大的使用量中90%的抗生素都是作為了動物飼料的添加劑而被消耗掉，致使動物的抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，出現(xiàn)了大量的耐藥菌株，為畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展埋下了隱患的同時也為人類的生命健康帶來了威脅[1]。

四環(huán)素類抗生素（tetracyclineantibiotics，TCs）是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括土霉素（Oxytetracycline，OTC）、四環(huán)素（Tetracycline，TC）和金霉素（Chlortetracycline，CTC）等。四環(huán)素類抗生素由于價格低廉，大量使用于許多疾病的預(yù)防與促進動物的生長，提高畜禽生產(chǎn)效率。但是禽畜組織中四環(huán)素類抗生素的殘留會影響食用者的健康，還會造成環(huán)境中四環(huán)素類抗生素的殘留，從而間接或直接進入人體，增加人體的耐藥性，給人類公共健康帶來威脅[2]。為了保護環(huán)境和人類健康，國際食品法典委員會（CAC）制定了動物組織及產(chǎn)品中獸藥殘留的最高殘留限量（MRLVDs）的規(guī)定，用以保障公眾健康和各國正常進出口貿(mào)易。我國也制定了國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定四環(huán)素類抗生素的添加限量，所有食用性動物肌肉組織中土霉素、四環(huán)素和金霉素的單個或復(fù)合物含量不得超過0.1 mg·kg-1。

獸藥殘留檢測方法目前主要有金標(biāo)檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-紫外檢測法[3]、氣相色譜法和質(zhì)譜法[4]等。四環(huán)素類抗生素最常用的化學(xué)檢測方法主要有高效液相色譜法[5]和高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法。本研究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，建立了一種高效液相色譜法快速檢測雞肉組織中土霉素類藥物殘留的方法，為臨床快速準(zhǔn)確檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

檢測方法驗證雞4羽；2個合作社飼養(yǎng)的烏骨雞各6羽。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）美國天地有限公司；甲醇（分析純）重慶川東化工（集團）有限公司；正己烷（分析純）天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；土霉素對照品、四環(huán)素對照品、金霉素對照品北京索萊寶科技有限公司。

高效液相色譜儀島津LC-2030(配紫外檢測器)；色譜柱C18 4.6×150 mm，5μm；氮吹儀HSC-24A天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為C18（4.6×150 mm，5μm）。以0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液-乙腈=81∶19（體積比）為流動相。檢測波長為350 nm，柱溫為40℃，流速為1.0 ml·min-1，進樣量為10 ul。

1.3.2 溶液的制備 分別稱取OTC、TC、CTC對照品各10 mg，置于三個10 ml的棕色容量瓶中，然后用甲醇溶液溶解并定容到10 ml，制備得到的OTC、TC、CTC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1 mg·ml-1。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取土霉素、四環(huán)素、鹽酸金霉素對照品各約100 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線得到10 mg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml，分別置100、50、25、10、5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻。得到濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.1和0.2 mg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液都放置與4～6℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品前處理 將組織剪碎稱取5 g，置于50 ml離心管中，加入25 ml甲醇，超聲5 min。8000 r·min-1，勻漿提取1 min。4 000 r·min-1離心15 min,將上清液移置150 ml的分液漏斗中。加入25 ml甲醇飽和的正己烷溶液，手動振搖2 min，靜置分層。取下層溶液20 ml，置于25 ml的旋蒸瓶中，41℃水浴減壓蒸干，加入1 ml5%的高氯酸，渦旋1 min，移至1.5 ml離心管中，10 000r·min-1離心15 min，將上清液吸出過0.45μm濾膜，將濾液作為試樣溶液待測。

出峰順序與時間的確定將配制好的1 mg·ml-1土霉素、四環(huán)素和金霉素三個標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，放入高效液相色譜儀進行檢測，每個樣品重復(fù)進樣6次，取平均值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定稱取9份已剪碎的樣品各5 ±0.01g，放入50 ml離心管中。分別加入50 ul不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2 mg·ml-1，配制成相對于樣品濃度為0.2、0.4、1、2、3、4、5、10、20μg·g-1，按照樣品前處理方法進行操作。繪制土霉素、四環(huán)素和金霉素三種四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取3份已經(jīng)剪碎的空白樣品各5±0.01 g，按照 0.3 mg·ml-1、0.4mg·ml-1和 0.5mg·ml-1添加量添加三種標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣品平行測定3次，計算樣品的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 一種高效液相色譜檢測雞肉中土霉素類抗生素方法

2.1.1 出峰順序與時間

如圖一所示：根據(jù)6次重復(fù)進樣得出平均出峰時間，土霉3.65min，四環(huán)素4.41 min，金霉素9.62 min。土霉素、四環(huán)素、金霉素依次出峰且分離度良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品出峰順序和時間

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在1.3.1色譜條件下進樣，已標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1，表明三種抗生素在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

表1 土霉素、四環(huán)素和金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 方法檢出限

按照樣品前處理的方法進行操作，經(jīng)過HPLC分析，得到土霉素、四環(huán)素的方法檢出限為20μg·kg-1，金霉素的方法檢出限為100μg·kg-1。

2.1.4 變異系數(shù)與添加回收率試驗

由表2顯示，三個空白樣品在三個不同濃度下的回收率范圍為84.33%～107%，回收率良好。

2.1.5 實驗組土霉素測定結(jié)果

將實驗組陽性對照和空白對照進行檢測，每個樣品平行測定三次，結(jié)果見表3，相關(guān)色譜圖見圖2。

圖2 A為土霉素陽性對照，B為空白對照

由表3可知，土霉素陽性對照組的胸肌和腿肌樣品檢測結(jié)果都超出獸藥最高殘留限量3～8倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過我國MRLVDs的規(guī)定（0.1mg·kg-1），空白對照組未檢出殘留。證明本方法成立。

表2 添加回收率與變異系數(shù)

表3 土霉素陽性對照檢測結(jié)果

2.2 雞場樣品測定與分析

采用1.3.3方法處理待測樣品，用1.3.1色譜條件進行檢測分析，色譜圖見圖3。檢測結(jié)果表明所有樣品都未檢測出土霉素、四環(huán)素和金霉素獸藥殘留。

圖3 C為待測樣品

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本研究樣品處理方法和GB/T20764—2006[6]方法有很大改進，本方法使用的是甲醇-正己烷-高氯酸組合提取法，此方法操作重現(xiàn)性好，便于批量處理。GB/T20764—2006所使用的萃取柱提取方法，這種提取方法雖然操作簡單，重現(xiàn)性差，并且成本高，不利于批量處理。而本方法尚有不足之處，樣品前處理步驟復(fù)雜，相對于固相萃取柱提取法耗時較長，因此，以后仍需要改進。

3.2 流動相選擇

以 78：22、81：19 和 85：15(V：V)進行了實驗 ,結(jié)果表明流動相為 81：19(V：V)的比例分離效果較好; 隨后又考察了0.8 ml/min 和 1.0 ml/min 的流速, 最終確定本實驗流速為 1ml/min。在此色譜條件下, 試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素均得到較好的分離,與高廣慧[7]結(jié)果一致。

3.3 波長的選擇

土霉素、四環(huán)素、金霉素在265 nm和350 nm兩個波長處都有較好的吸收峰[8]，而在265 nm波長下，吸收強度好，與鮑會梅所得結(jié)果相符合，但色譜圖的基線不如前者平穩(wěn)，綜合考量，選擇350 nm為檢測波長。

4 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜測定雞肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、藥物殘留的方法，采用甲醇-正己烷-高氯酸組合提取法，建立了雞肉樣品提取、凈化、濃縮的前處理方法，并優(yōu)化了高效液相色譜條件，可同時測定雞肉中上述3種四環(huán)素類藥物殘留，該法簡便、準(zhǔn)確，可用于該類獸藥的殘留監(jiān)控。

從待測樣品的檢測結(jié)果來看，此農(nóng)戶家養(yǎng)殖的雞土霉素、四環(huán)素和金霉素的陽性檢出率為零。