從TGF-β1/Smad信號(hào)通路角度探討宮腔粘連中醫(yī)痰凝血瘀腎虛的發(fā)病機(jī)制

侯建峰， 張瀟涵， 吳怡平， 朱賢強(qiáng)， 杜娟， 翟家樂(lè)， 黎麗娜

（廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院婦科病理科，廣東珠海 519000）

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）是近年來(lái)常見(jiàn)的，可造成女性生育功能下降，嚴(yán)重影響女性生殖生理及身心健康的婦科疾病。目前，西醫(yī)治療以宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)（transcervical resection of adhesion，TCRA）為主，術(shù)后輔助以防粘連制劑、雌孕激素人工周期、宮內(nèi)節(jié)育器等。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療IUA方面進(jìn)行了有益的探索。本課題組前期通過(guò)總結(jié)IUA中醫(yī)證候及宮腔鏡下所見(jiàn)，并結(jié)合IUA中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展，首次提出了痰凝血瘀腎虛是IUA的主要中醫(yī)發(fā)病機(jī)制[1]。為探討IUA痰凝血瘀腎虛病機(jī)的現(xiàn)代基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了IUA患者內(nèi)膜組織中TGF-β1與Smad2/3的表達(dá)，并以祛痰化瘀補(bǔ)腎法治療IUA，觀察其臨床療效及對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響，以期從現(xiàn)代信號(hào)通路角度闡述IUA的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象及分組收集2017年7月至2019年1月間廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院收治的經(jīng)宮腔鏡確診為IUA的患者，共40例，采用免疫組化方法檢測(cè)其宮腔粘連組織中TGF-β1與Smad2/3的表達(dá)。另取在我科因其他原因（如宮頸息肉、子宮縱隔）行宮腔鏡手術(shù)的非IUA患者20例作為對(duì)照，同時(shí)，IUA患者非粘連處內(nèi)膜亦取樣檢測(cè)。然后，采用隨機(jī)數(shù)字表將40例IUA患者隨機(jī)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組各20例，分別在TCRA術(shù)后采用祛痰化瘀補(bǔ)腎法及雌孕激素人工周期治療，治療2個(gè)月經(jīng)周期后復(fù)查宮腔鏡，再次檢測(cè)其TGF-β1與Smad2/3的表達(dá)。治療前，2組IUA患者及對(duì)照組非IUA患者的年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2治療方法

1.2.1 試驗(yàn)組 在手術(shù)第2天開(kāi)始服用祛痰化瘀補(bǔ)腎方治療。處方：熟地黃10 g，淮山15 g，山茱萸10 g，丹參20 g，赤芍10 g，川牛膝15 g，蒼術(shù)10 g，法半夏10 g，橘紅10 g，甘草6 g，每日1劑，連服11 d；然后改用：熟地黃10 g，淮山15 g，山茱萸10 g，川續(xù)斷15 g，杜仲10 g，丹參20 g，赤芍10 g，川牛膝15 g，蒼術(shù)10 g，法半夏10 g，橘紅10 g，甘草6 g，每日1劑，再服10 d。

1.2.2 對(duì)照組 在手術(shù)后第2天開(kāi)始應(yīng)用雌孕激素人工周期治療。用法：補(bǔ)佳樂(lè)（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20171038），每次2 mg，每日2次，共21 d；后10 d加用黃體酮膠囊（浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20041902），每次200 mg，每日1次。

1.2.3 療程 2組患者均治療2個(gè)月經(jīng)周期。

1.3免疫組化檢查試劑：兔抗人TGF-β1、兔抗人Smad2/3抗體及SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司。免疫組化試驗(yàn)步驟根據(jù)SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判定與評(píng)分參照文獻(xiàn)[2]：①根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別給予1～5分。1分：1%～10%；2分：11%～25%；3分：26%～50%；4分：51%～75%：5分：＞75%。②根據(jù)染色信號(hào)強(qiáng)弱分為3級(jí)，分別給予1～3分。1分：淺棕黃色信號(hào)，強(qiáng)于背景；2分：棕黃色中等強(qiáng)度信號(hào)；3分：棕褐色強(qiáng)信號(hào)。上述2項(xiàng)評(píng)分相加再除以2，為每個(gè)切片的最后計(jì)分。

1.4臨床觀察指標(biāo)中國(guó)宮腔粘連診斷分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]涵蓋了粘連范圍、粘連性質(zhì)、輸卵管開(kāi)口狀態(tài)、子宮內(nèi)膜厚度、月經(jīng)狀態(tài)等項(xiàng)目，故以該評(píng)分為觀察指標(biāo)。臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)：治愈：宮腔鏡下宮腔形態(tài)正常，未見(jiàn)粘連，雙側(cè)輸卵管開(kāi)口可見(jiàn)。有效：未達(dá)治愈標(biāo)準(zhǔn)，但按中國(guó)宮腔粘連診斷分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，減輕1個(gè)分級(jí)。無(wú)效：評(píng)分分級(jí)較治療前無(wú)改善。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SSPS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s精確概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUA患者宮腔粘連組織中TGF-β1、Smad2/3的表達(dá)情況結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 2組IUA患者治療前后宮腔粘連組織中TGFβ1和Smad2/3的表達(dá)水平比較治療后第2次宮腔鏡檢查時(shí)，對(duì)于未再見(jiàn)粘連組織者，不再取標(biāo)本。對(duì)于仍有粘連者（試驗(yàn)組13例、對(duì)照組11例），再于粘連處取樣，檢測(cè)TGF-β1和Smad2/3的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)表1。治療前，2組患者粘連組織中TGF-β1和Smad2/3表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2組患者粘連組織中TGF-β1和Smad2/3的表達(dá)水平均較治療前明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但治療后組間TGF-β1和Smad2/3表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 IUA患者宮腔粘連組織TGF-β1、Smad2/3的表達(dá)情況Figure 1 Expression of TGF-β1 and Smad2/3 in the adhesion tissues of IUA patients

表1 2組IUA患者治療前后宮腔粘連組織中TGF-β1和Smad2/3表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of TGF-β1 and Smad2/3 expression levels in the adhesion tissues of IUA patients of the two groups before and after treatment

表1 2組IUA患者治療前后宮腔粘連組織中TGF-β1和Smad2/3表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of TGF-β1 and Smad2/3 expression levels in the adhesion tissues of IUA patients of the two groups before and after treatment

①P＜0.05，與治療前比較

組別試驗(yàn)組對(duì)照組N TGF-β1 Smad2/3差值0.50±0.22 0.59±0.20 13 11治療前2.52±0.59 2.55±0.52治療后2.06±0.68①1.91±0.66①差值0.47±0.32 0.64±0.45治療前2.45±0.52 2.41±0.58治療后1.95±0.52①1.81±0.60①

2.3 2組患者治療后臨床療效比較表2結(jié)果顯示：治療后，根據(jù)中國(guó)宮腔粘連診斷和分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的總有效率分別為90.0%和95.0%，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.360，P=0.548）。

表2 2組患者治療后臨床療效比較Table 2 Comparison of clinicalefficacy in the two gorups after treatment n（p/%）

3 討論

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中對(duì)宮腔粘連（IUA）無(wú)專門論述，可參見(jiàn)“月經(jīng)過(guò)少”、“閉經(jīng)”等的辨證論治。本課題組在總結(jié)IUA的臨床特點(diǎn)后認(rèn)為，IUA繼發(fā)于多次人工流產(chǎn)或刮宮術(shù)后等，病因較為明確，臨床表現(xiàn)較為一致，故認(rèn)為是中醫(yī)婦科“月經(jīng)過(guò)少”或“閉經(jīng)”中的一個(gè)特殊證型，無(wú)需再對(duì)IUA進(jìn)一步分型辨證。宮腔鏡拓展了我們的臨床所見(jiàn)，亦應(yīng)做為辨證參考。我們認(rèn)為，IUA早期宮腔鏡下見(jiàn)膜樣或網(wǎng)狀疏松粘連，取類比象，與中醫(yī)“痰凝”有關(guān)?，F(xiàn)代研究[4，5]認(rèn)為，粘附分子在IUA形成中起重要作用。正常水平表達(dá)的粘附分子屬中醫(yī)學(xué)“津液”范疇，參加正常生理過(guò)程；而病理性升高的粘附分子則屬于“痰濁”。故我們認(rèn)為，IUA的發(fā)病機(jī)制為流產(chǎn)、刮宮等宮腔操作損傷胞脈胞絡(luò)，津液外滲，凝聚成痰，痰邪阻滯氣血，進(jìn)一步形成血瘀，痰瘀互結(jié)，形成宮腔局部粘連，導(dǎo)致月經(jīng)過(guò)少，甚則閉經(jīng)、不孕。痰瘀日久，又可損傷腎氣，進(jìn)一步加重各臨床表現(xiàn)，故痰凝血瘀腎虛是IUA的主要中醫(yī)病理機(jī)制[1]。

目前認(rèn)為成纖維細(xì)胞增生活躍是導(dǎo)致IUA的主要病理機(jī)制[6]，TGF-β可激活和調(diào)控纖維化病變的發(fā)生，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的表型和功能[7]。Hu J等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IUA患者子宮內(nèi)膜纖維化面積增加，并且TGF-β1作為纖維化標(biāo)記物在IUA患者子宮內(nèi)膜中高表達(dá)。TGF-β1可通過(guò)與細(xì)胞膜受體結(jié)合，激活受體后，可誘導(dǎo)Smad2/3發(fā)生磷酸化，再與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[9]，從而促進(jìn)纖維粘連蛋白、膠原蛋白等基質(zhì)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，加速纖維粘連形成。本研究也顯示，與正常內(nèi)膜相比，宮腔粘連組織中TGF-β1和Smad2/3表達(dá)明顯增高。結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)研究對(duì)粘附分子與痰邪關(guān)系的研究，可認(rèn)為IUA發(fā)生早期與痰凝有關(guān)，TGF-β1/Smad信號(hào)通路異常，可能是IUA痰凝血瘀腎虛病機(jī)的現(xiàn)代基礎(chǔ)。

臨床觀察顯示，補(bǔ)腎祛痰化瘀方輔助TCRA治療IUA起到了較好的臨床效果，總有效率與雌孕激素人工周期輔助治療效果接近。有研究[10，11]顯示，雌孕激素人工周期治療IUA預(yù)防再發(fā)的作用已得到證實(shí)，故認(rèn)為補(bǔ)腎祛痰化瘀方治療IUA有較好的臨床效果。其中醫(yī)作用機(jī)制，是針對(duì)IUA的痰凝血瘀腎虛病機(jī)，方中蒼術(shù)、法半夏、橘紅燥濕祛痰；丹參、赤芍、川牛膝活血化瘀；熟地黃、淮山、山茱萸補(bǔ)腎，后半期加用川續(xù)斷、杜仲取補(bǔ)腎調(diào)周之意；川牛膝引藥下行，甘草調(diào)和諸藥；諸藥合用，共奏補(bǔ)腎祛痰化瘀之功效。

中醫(yī)現(xiàn)代研究表明，化痰祛瘀藥有調(diào)節(jié)粘附分子表達(dá)的作用。如陳剛毅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，化痰祛瘀中藥處理腹膜纖維化大鼠，能夠降低TGF-β1/Smad通路成分的表達(dá)。本研究也顯示，補(bǔ)腎祛痰化瘀方可降低宮腔粘連組織中TGF-β1和Smad2/3表達(dá)。結(jié)果提示，對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，可能是針對(duì)IUA的痰凝血瘀腎虛病機(jī)治療起效的現(xiàn)代機(jī)制。