開郁清熱方通過調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞凋亡保護(hù)胰島功能的機(jī)制研究

宋軍， 甄仲， 鄧嵐， 仝小林

（中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

糖尿病的發(fā)生是由于胰島細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠胰島素和/或胰島素抵抗所致，其整個病程都伴隨著胰島功能的衰竭。1型糖尿病和2型糖尿病胰島功能衰竭產(chǎn)生的機(jī)制是不同的。1型糖尿病主要是胰島β細(xì)胞因自身免疫而凋亡，致胰島素生成缺失，炎癥在這個過程中起著很重要的作用。2型糖尿病胰島功能衰竭與細(xì)胞因子、游離脂肪酸和持續(xù)的高糖環(huán)境密切相關(guān)，在這些因素的長期影響下，胰島素分泌被抑制，胰島β細(xì)胞凋亡增加[1]。胰島素瘤細(xì)胞株（INS-1）源自X射線照射的移植胰島瘤的大鼠，胰島素陽性，可合成胰島素原Ⅰ和Ⅱ，是比較公認(rèn)的一種用于胰島β細(xì)胞功能研究的細(xì)胞模型[2]，故本研究選取INS-1細(xì)胞構(gòu)建胰島功能衰竭模型。本研究圍繞INS-1凋亡，探討肥胖型2型糖尿病胰島β細(xì)胞病變與中藥開郁清熱方的干預(yù)作用及機(jī)理，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源及培養(yǎng)大鼠INS-1細(xì)胞由解放軍307醫(yī)院贈送。以RPMI-1640培養(yǎng)基加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青鏈霉素，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的條件下無菌培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，每24 h更換培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%后細(xì)胞傳代、凍存。

1.2主要藥物與試劑開郁清熱方（主要由黃連、大黃、白芍、柴胡、天花粉等組成）由天士力集團(tuán)提供；馬來酸羅格列酮片[葛蘭素史克（天津）有限公司，批號：09060108]。軟脂酸、牛血清白蛋白BSA（美國Sigma公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）；SYBR Green PCR Master Mix（美國Thermo Fisher Scientific公司）；引物采用primer premier 5.0軟件設(shè)計，由上海賽百盛公司合成；兔抗大鼠多克隆抗體p53、Bax、Bcl-2（武漢博士德有限公司，稀釋度為1∶100）。

1.3主要儀器GeneAmp 5700 TaqMAN PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；ImageMaster VDS凝膠圖像分析儀（美國Pharmacia Biotech公司）；Allagra.21R高速冷凍離心機(jī)、紫外線分光光度計（德國Backman公司）；DU640型核酸蛋白分析儀（美國Backman公司）；OYY-Ⅲ-5型電泳儀（北京六一儀器廠）；Image Pro Plus圖像分析軟件。

1.4含藥血清的制備SD大鼠30只，雄性，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量（200±21）g，購自北京維通利華實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2012-0001。以開郁清熱方水煎劑按體表面積折算的等效劑量給SD大鼠灌胃[3]，每日2次，連續(xù)3 d。血清對照組大鼠給予同體積的生理鹽水灌胃。末次灌胃前禁食12 h，末次灌胃后1 h，腹主動脈采血，靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，經(jīng)56℃30 min滅活處理后，用0.45μm（或0.22μm）微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5模型的建立及分組將INS-1細(xì)胞分為正常組、高糖誘導(dǎo)組、血清對照組、中藥小劑量組、中藥大劑量組、羅格列酮組共6組。每組5個復(fù)孔。

1.5.1 正常組 取同代INS-1細(xì)胞置于含完全RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，后以完全RPMI-1640培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5.2 高糖誘導(dǎo)組 取同代INS-1細(xì)胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)5 d，后以完全RPMI-1640培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5.3 血清對照組 取同代INS-1細(xì)胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)5 d，后以正常大鼠血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5.4 中藥小劑量組 取同代INS-1細(xì)胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L內(nèi)培養(yǎng)5 d，后以5%含藥血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5.5 中藥大劑量組 取同代INS-1細(xì)胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L內(nèi)培養(yǎng)5 d，后以10%含藥血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5.6 羅格列酮組 取同代INS-1細(xì)胞置于含高濃度葡萄糖20 mmol/L內(nèi)培養(yǎng)5 d，后以含1 mol/L羅格列酮鈉片的完全RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.6指標(biāo)檢測與方法

1.6.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集數(shù)目（1～5）×106個/mL細(xì)胞，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇4℃固定1～2 h。離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min。400目的篩網(wǎng)過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。用1 mol/L碘化丙啶（PI）染液染色，4℃避光30 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測Sirt1、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）mRNA表達(dá) 選用β-actin作為內(nèi)參照以進(jìn)行RT-PCR半定量分析。設(shè)計引物如下：①r-Sirt1-F：5’-TTGGCACC GATCCTCGAA C-3’；r-Sirt1-R：5’-CCCAGCTC CAGTCAGAACTAT-3’。②r-FOXO1-F：5’-ATC CGCTGCCTGCAGTGGACC-3’；r-FOXO1-R：5’-C CTTGTCCAGCATGAGGTTCTCC-3’。③β-actin-A：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；β-actin-S：5’-AATGTCACGCACGATTTCCC-3’。RT-PCR反應(yīng)體系按試劑盒說明書進(jìn)行制備。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃25 s，55℃25 s，72℃50 s，40個循環(huán)；72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束計算CT值，為避免假陽性信號，使用熔解曲線來檢查非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。以β-actin基因為內(nèi)標(biāo)參照，使用比較法（△△CT）來計算基因的相對定量（p）。

1.6.3 免疫組化法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、p53蛋白表達(dá) 將做好的細(xì)胞爬片在室溫自然干燥后置于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中固定20 min，于室溫下在3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水洗2次。微波熱修復(fù)抗原，然后室溫冷卻。PBS清洗，擦干，加山羊血清封閉20 min，傾去血清，直接加兔抗大鼠多克隆抗體p53/Bax/Bcl-2（稀釋度均為1∶100），4℃濕盒過夜。PBS清洗，加山羊抗兔IgG，37℃20 min，PBS清洗，加鏈酶親和素—過氧化物酶抗體（SABC）試劑，37℃20 min，PBS清洗，DAB顯色，最后蘇木素輕度復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性結(jié)果以高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個視野，以細(xì)胞或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色為陽性反應(yīng)，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)的百分率。陰性對照以PBS代替一抗，其余同。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)而用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組INS-1細(xì)胞凋亡率比較Table 1 Comparison of the apoptosis rate in INS-1 cells of various groups （s，p/%）

表1 各組INS-1細(xì)胞凋亡率比較Table 1 Comparison of the apoptosis rate in INS-1 cells of various groups （s，p/%）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與高糖誘導(dǎo)組比較；③P＜0.05，與血清對照組比較；④P＜0.05，與羅格列酮組比較

細(xì)胞凋亡率1.46±0.37③31.10±4.76①31.20±4.57①27.74±3.44①④20.99±3.42①②③20.98±2.95①②③組別正常組高糖誘導(dǎo)組血清對照組中藥小劑量組中藥大劑量組羅格列酮組n6 6 6 6 6 6

2 結(jié)果

2.1各組INS-1細(xì)胞凋亡率比較表1、圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，高糖誘導(dǎo)組，血清對照組，中藥大、小劑量組及羅格列酮組INS-1細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）；與高糖誘導(dǎo)組和血清對照組比較，中藥大劑量組、羅格列酮組INS-1細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），且2組作用效果近似。表明大劑量開郁清熱方可有效保護(hù)胰島β細(xì)胞，減低胰島β細(xì)胞凋亡。

圖1 各組INS-1細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖Figure 1 The flow cytometry plot for the apoptosis of INS-1 cells in various groups

圖2 各組INS-1細(xì)胞Sirt1、FOXO1 mRNA表達(dá)的比較Figure 2 Comparison of the mRNA expression levels of Sirt1 and FOXO1 in various groups（s，n=3）

2.2各組INS-1細(xì)胞Sirt1、FOXO1 mRNA表達(dá)的比較圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，高糖誘導(dǎo)組和血清對照組INS-1細(xì)胞Sirt1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)OXO1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖誘導(dǎo)組和血清對照組比較，中藥大、小劑量組INS-1細(xì)胞Sirt1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)OXO1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），羅格列酮組INS-1細(xì)胞僅Sirt1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。提示開郁清熱方可抑制胰島β細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與升高胰島β細(xì)胞Sirt1 mRNA表達(dá)，降低FOXO1 mRNA表達(dá)有關(guān)。

2.3各組INS-1細(xì)胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá)的比較表2、圖3～5結(jié)果顯示：與正常組比較，高糖誘導(dǎo)組和血清對照組INS-1細(xì)胞Bax、p53蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與高糖誘導(dǎo)組和血清對照組比較，中藥大劑量組、羅格列酮組INS-1細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。雖然與高糖誘導(dǎo)組比較，中藥大劑量組及羅格列酮組p53蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05），但這2組p53較血清對照組顯著降低（P＜0.05）。表明大鼠血清可影響INS-1細(xì)胞p53的表達(dá)，大劑量開郁清熱方及羅格列酮對p53有一定的降低作用。提示開郁清熱方可抑制INS-1細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與升高INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax、p53蛋白表達(dá)有關(guān)。

表2 各組INS-1細(xì)胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá)的比較Table 2 Comparison of the protein expression levels of Bax，Bcl-2 and p53 in various groups（s，n=3）

表2 各組INS-1細(xì)胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá)的比較Table 2 Comparison of the protein expression levels of Bax，Bcl-2 and p53 in various groups（s，n=3）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與高糖誘導(dǎo)組比較；③P＜0.05，與血清對照組比較；④P＜0.05，與羅格列酮組比較

p53 0.083±0.019 0.129±0.022①0.148±0.018①②0.138±0.027①0.119±0.01①③0.123±0.009①③組別正常組高糖誘導(dǎo)組血清對照組中藥小劑量組中藥大劑量組羅格列酮組Bax 0.090±0.016 0.135±0.014①0.146±0.003①0.132±0.011①④0.107±0.009②③0.099±0.008②③Bcl-2 0.135±0.033 0.094±0.002①0.098±0.012①0.121±0.003④0.123±0.009②③④0.149±0.021②③

圖3 各組INS-1細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的比較（免疫組化法，×400）Figure 3 Comparison of the protein expression of Bax in INS-1 cells of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖4 各組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（免疫組化法，×400）Figure 4 Comparison of the protein expression of Bcl-2 in INS-1 cells of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖5 各組INS-1細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的比較（免疫組化法，×400）Figure 5 Comparison of the protein expression of p53 in INS-1 cells of various groups（by immunohistochemistry，×400）

3 討論

3.1開郁清熱方對胰島β細(xì)胞凋亡的作用近年來，糖尿病患者日趨增多，且隨著糖尿病患者病程的持續(xù)，其胰島β細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，胰島β細(xì)胞功能呈進(jìn)行性下降。細(xì)胞凋亡是胰島β細(xì)胞數(shù)量減少的最終形式，而胰島β細(xì)胞衰竭所致的胰島素分泌不足是血糖升高的主要原因。目前，針對胰島β細(xì)胞凋亡的防治手段非常有限，因此有必要開發(fā)對胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用的藥物[4]。開郁清熱方是仝小林教授在“脾疸”理論指導(dǎo)下研發(fā)的治療2型糖尿病（肝胃郁熱證）的中藥方劑，有開郁清胃、滋陰降火、通腑瀉濁的功效。課題組前期研究結(jié)果表明，開郁清熱方（糖敏靈）可有效地控制初治、超體質(zhì)量2型糖尿病患者的糖化血紅蛋白，達(dá)標(biāo)率大于50.0%，明顯高于安慰劑組。開郁清熱方（糖敏靈）可明顯降低空腹血糖、餐后2 h血糖，血糖實測值、達(dá)標(biāo)率均明顯高于安慰劑[5]。

本研究選取被廣泛用于研究β細(xì)胞生長及存活因子的胰島β細(xì)胞系，進(jìn)行高糖培養(yǎng)以誘導(dǎo)胰島細(xì)胞功能損傷模型[6，7]，通過含藥血清干預(yù)進(jìn)一步探討開郁清熱方對INS-1細(xì)胞凋亡的防治作用。結(jié)果顯示，開郁清熱方大劑量組及羅格列酮組均能有效降低高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡率，且2組作用效果近似。表明經(jīng)大劑量開郁清熱方處理后可有效保護(hù)胰島β細(xì)胞細(xì)胞，減低胰島β細(xì)胞凋亡。

3.2開郁清熱方對INS-1細(xì)胞Sirt1、FOXO1的調(diào)節(jié)作用Sirt基因家族主要通過參與染色質(zhì)沉默以及能量代謝而調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老過程。其中Sirt1編碼的蛋白為核蛋白，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的脫乙酰酶，有研究證實在不同組織中Sirt1發(fā)揮著促進(jìn)脂肪動員[8]、降低轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的凋亡[9]、抑制增殖[10]、增加胰島素分泌[11]等作用。FOXO1是叉頭轉(zhuǎn)錄因子O家族成員之一，受Sirt1調(diào)節(jié)。Yang等[12]研究揭示，在細(xì)胞核內(nèi)Sirt1蛋白可結(jié)合并去乙酰化FOXO1。在哺乳動物細(xì)胞中，Sirt1通過在叉頭DNA結(jié)合區(qū)內(nèi)將3個賴氨酸殘基脫乙?；瘉碚{(diào)節(jié)FOXO1的活性[13]?；罨腇OXO1進(jìn)一步影響B(tài)ax、Bcl-2、p53等，從而影響INS-1細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果表明，開郁清熱方可能通過有效升高INS-1細(xì)胞Sirt1 mRNA表達(dá)，降低FOXO1 mRNA表達(dá)，從而調(diào)控相關(guān)信號通路影響胰島β細(xì)胞的凋亡。

3.3開郁清熱方對INS-1細(xì)胞Bcl-2、Bax、p53的調(diào)節(jié)作用Bcl-2與Bax共屬于一個家族，通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)凋亡激活物如細(xì)胞色素C的釋放來影響細(xì)胞的狀態(tài)。Bax二聚體在膜上打開通道，增加通透性；Bcl-2與Bax形成異聚體，降低通透性。故Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明細(xì)胞對凋亡的抵抗性增強(qiáng)，可看作是保護(hù)藥物起作用的標(biāo)志；而反之則相反[14]。有研究表明，Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細(xì)胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用，而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，具有促凋亡作用，p53可上調(diào)Bax的表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[15]。

本研究結(jié)果表明，大劑量開郁清熱方可有效升高Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax、p53蛋白表達(dá)，從而抑制胰島β細(xì)胞的凋亡過程，增加細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)胰島素的分泌。另外，在研究過程中，因Sirt1和Akt蛋白表達(dá)較低未能測出，故僅提供PCR研究結(jié)果。