川骨片對家兔激素性股骨頭缺血性壞死ERK1/2、JNK、p38磷酸化蛋白的影響

周毅， 楊世鵬， 趙智慧， 陳靖文， 張雄衛(wèi)， 周天， 江中潮

（1.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川成都 610075；2.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶 400010；3.成都中醫(yī)藥大學，四川成都 610075）

激素性股骨頭缺血性壞死（steroid induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由于糖皮質(zhì)激素大量使用導致骨內(nèi)循環(huán)障礙、骨代謝失衡、破骨細胞增多而成骨細胞凋亡，破壞股骨頭局部血運，引起缺血、壞死，繼而導致股骨頭塌陷、骨折的一種骨疾病。近年來，由于糖皮質(zhì)激素在臨床治療中的濫用，SANFH的發(fā)病率日漸增高，占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位，起病隱襲，病情發(fā)展較快，致殘性強，已成為困擾醫(yī)患的重大公共難題之一[1，2]。本院院內(nèi)制劑川骨片對SANFH有顯著臨床療效，但其機制尚不明確。分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞的生長、分化、炎癥反應等具有調(diào)節(jié)作用[3]。本研究以SANFH家兔模型為研究對象，觀察川骨片對MAPK信號通路主要成員蛋白細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38表達的影響，探討其作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性日本大耳兔56只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由成都中醫(yī)藥大學實驗中心提供（許可證號：川實動管第99011號），檢疫合格備用。本研究動物飼養(yǎng)及動物實驗均在成都中醫(yī)藥大學實驗中心完成，室內(nèi)保持恒定溫度及濕度，相對濕度為45%～60%。

1.2實驗藥物及制備川骨片，由續(xù)斷、骨碎補、黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地、丹參、菟絲子、枸杞、補骨脂、杜仲、當歸、牛膝、乳香、沒藥、紅花、獨活、威靈仙、白術、茯苓、甘草等組成，由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院生產(chǎn)，批準文號：川藥制字Z20070657。仙靈骨葆膠囊（貴州同濟堂制藥有限公司，批準文號：國藥準字Z20025337），主要由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃等組成，研究已證明本品能抑制破骨細胞的吸收活動，加快骨再建活動，刺激骨形成，提高骨密度，是臨床上用于股骨頭壞死治療的有效制劑，本實驗中作為陽性對照藥物進行研究。將川骨片（規(guī)格：0.3 g/片）使用蒸餾水熬制為水劑，制備為生藥量0.6 g/mL混懸液體。將仙靈骨葆膠囊（規(guī)格：0.5 g/粒）用蒸餾水熬制為水劑，制備為含成藥仙靈骨葆膠囊0.6 g/mL的混懸藥液。藥液均于0～4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤幰褐苽湮谐啥贾嗅t(yī)藥大學附屬醫(yī)院制藥車間完成。醋酸潑尼松龍（華中藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：5 mL∶0.125 g，生產(chǎn)批號：20171203）。

1.3主要試劑與儀器p-ERK1/2、p-JNK和p-p38抗體（美國CST公司）；GAPDH（武漢普健生物公司）。BCA蛋白定量檢測試劑盒、RIPA lysis buffer（上海碧云天公司）；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（武漢普健生物公司）；蛋白預染marker（美國Thermo Scientific公司）。TVO.63XC-MO HE染色成像系統(tǒng)（廣州明美公司）；PP1152電泳儀（上海CAVOY公司）；EPS600C電轉(zhuǎn)儀（上海天能公司）；TS-8S脫色搖床（江蘇其林貝爾公司）；ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；PerkinElmer全功能微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司）。

1.4分組與造模將56只雄性大耳兔隨機分成2組，即空白組（16只）和造模組（40只）。適應性喂養(yǎng)1周后，造模組采用賀西京造模法復制SANFH模型[4]：于兔右側(cè)臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍8 mg/kg，每周2次，連續(xù)注射6周?？瞻捉M右側(cè)臀肌注射等量生理鹽水，每周2次，連續(xù)注射6周。所有動物左側(cè)臀肌預防性注射青霉素8萬U/kg，預防感染，每周2次，共6周。6周后處死空白組4只和模型組4只進行模型鑒定。在無菌條件下取出右側(cè)股骨頭，采用蘇木素—伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察骨小梁、骨細胞、髓腔及造血細胞形態(tài)、結(jié)構和數(shù)量的變化，并在股骨頭軟骨下區(qū)骨組織上隨機選擇10個高倍視野，計算每個視野中所有骨陷窩數(shù)和空骨陷窩數(shù)，計算出空骨陷窩率，判斷造模是否成功。空骨陷窩率=空骨陷窩數(shù)/全部骨陷窩數(shù)×100%。

1.5給藥方法造模成功后剩余的36只造模組兔再隨機分為模型對照組、川骨片治療組、仙靈骨葆膠囊治療組，每組12只。按成人60 kg體質(zhì)量換算法[5]換算，川骨片治療組給予川骨片（劑量為0.6 g·kg-1·d-1）灌胃，仙靈骨葆膠囊治療組給予仙靈骨葆膠囊（劑量為0.6 g·kg-1·d-1）灌胃，模型對照組給予蒸餾水1 mL/kg灌胃，空白組不做任何處理，連續(xù)灌胃42 d。

1.6觀察指標與方法

1.6.1 取材 采用空氣栓塞法處死各組家兔，在無菌條件下取出家兔右側(cè)股骨，取下股骨頭冠狀面剖開分別置于40 g/L多聚甲醛、液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 光鏡觀察股骨頭組織形態(tài) 將組織放入配好的混合酸脫鈣液中進行脫鈣，脫水機內(nèi)依次梯度酒精進行脫水，浸好蠟的組織于包埋機內(nèi)進行包埋，石蠟切片機切片，片厚4μm，HE染色，樹膠封片供鏡檢。

1.6.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測股骨頭組織p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表達 將組織剪碎，加入配制好的RIPA裂解液中，然后進行離心等處理，用BCA試劑盒檢測總蛋白含量。12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，一抗（p-ERK1/2 1∶2 000稀釋，p-JNK 1∶1 000稀釋，pp38 1∶1 000稀釋，GAPDH 1∶5 000稀釋）4℃過夜孵育，室溫二抗孵育1 h，ECL化學發(fā)光試劑盒顯影，洗片。膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像。用Image J軟件計算目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度比值（p）。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（-x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，股骨空骨陷窩率（p/%）組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1家兔股骨頭光鏡鏡檢結(jié)果空白組：軟骨細胞以及骨細胞基質(zhì)紅染，染色均勻，軟骨細胞排列規(guī)則整齊，組織結(jié)構清晰可見，潮線完整。股骨頭部骨小梁完整無明顯變形、斷裂，排列規(guī)則，骨組織內(nèi)可見大量活躍的成骨細胞，骨陷窩稀少，滋養(yǎng)血管豐富，髓腔內(nèi)可見大量形態(tài)規(guī)則的造血細胞，整個組織的結(jié)構完整，其中僅可見極少的脂肪細胞。模型對照組：軟骨細胞破壞明顯，細胞變形，不規(guī)則，整個軟骨層組織排列粗糙不平整，可見較寬的細胞間隙直達深層組織，部分動物可見股骨頭軟骨細胞完全剝離，軟骨組織結(jié)構模糊不清，潮線明顯中斷。骨組織的骨小梁變細，稀疏，排列不規(guī)則，結(jié)構紊亂，骨小梁之間的間距增寬，骨髓內(nèi)中可見大量分布的脂肪細胞，而骨細胞則變形萎縮，在組織邊緣聚集，組織內(nèi)可見大量骨陷窩存在。川骨片治療組：鏡下可見關節(jié)軟骨輕度變性，軟骨表面細胞排列不規(guī)則，粗糙不整，軟骨下骨組織內(nèi)可見較豐富的血管分布，骨組織的四層結(jié)構基本清晰，潮線不連續(xù)，鏡下可見少量炎性細胞增生，骨小梁較模型對照組粗大，骨髓腔內(nèi)可見造血細胞散在分布，大部分的骨細胞形態(tài)結(jié)構正常，骨組織內(nèi)鏡下可見的空骨陷窩較模型對照組有所減少。仙靈骨葆膠囊治療組：鏡下可見關節(jié)軟骨輕度變性，軟骨表面細胞排列不規(guī)則，粗糙不整，軟骨下骨組織內(nèi)可見較豐富的血管分布，骨組織的四層結(jié)構基本清晰，潮線不連續(xù)，鏡下可見少量炎性細胞增生，骨小梁較模型對照組粗大，骨髓腔內(nèi)可見造血細胞散在分布，大部分的骨細胞形態(tài)結(jié)構正常，骨組織內(nèi)鏡下可見的空骨陷窩較模型對照組有所減少。結(jié)果見圖1。

圖1 家兔股骨頭組織光鏡鏡檢報告（HE染色，×200）Figure 1 Light microscope of rabbit femoralhead tissue（by HE staining，×200）

圖2 造模組與空白組家兔股骨空骨陷窩率比較Figure 2 Comparison of the rate of empty bone lacuna in the modeling group and blank group

圖3 各組家兔第13周股骨空骨陷窩率比較Figure 3 Comparison of hollow bone lacuna rate in various groups on the 13th week

表3 各組家兔股骨頭組織p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of p-ERK1/2，p-JNK，p-p38 in rabbit femoral head tissue of various groups （，p）

表3 各組家兔股骨頭組織p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of p-ERK1/2，p-JNK，p-p38 in rabbit femoral head tissue of various groups （，p）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型對照組比較

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2.2各組家兔股骨空骨陷窩率比較圖2結(jié)果顯示：造模組家兔股骨空骨陷窩率明顯高于空白組（P＜0.05）。表明糖皮質(zhì)類激素可以導致骨細胞的破壞，導致空骨陷窩率明顯升高。提示實驗前期造模成功。圖3結(jié)果顯示：第13周時，與模型對照組比較，川骨片治療組、仙靈骨葆膠囊治療組的空骨陷窩率明顯較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；川骨片治療組空骨陷窩率與仙靈骨葆膠囊治療組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.0.5）。

2.3各組家兔股骨頭組織p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表達比較表3、圖4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型對照組家兔股骨頭組織p-ERK1/2蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），p-JNK、p-p38蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組對照比較，川骨片、仙靈骨葆膠囊治療組家兔股骨頭組織p-ERK1/2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），p-JNK、p-p38蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而川骨片治療組p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表達水平與仙靈骨葆膠囊治療組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 p-ERK1/2、p-JNK、p-p38蛋白電泳條帶Figure 4 Electrophoresis strips of p-ERK1/2，p-JNK and p-p38 proteins in various groups

3 討論

目前，激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）的發(fā)病機制仍不明確，存在高凝低纖溶微血管血栓栓塞學說、脂肪代謝紊亂學說、骨內(nèi)高壓學說、二次碰撞學說、遺傳以及基因多態(tài)性學說等[6-8]。但股骨頭缺血壞死的發(fā)病機制更多集中于分子生物學水平細胞增殖、分化、凋亡的研究。MAPK通路在促進細胞增殖、分化、抑制其凋亡中發(fā)揮重要作用。ERK1/2、p38、JNK是MAPK家族的主要成員。活化的MAPK通過級聯(lián)反應將外界信號傳遞給細胞核，通過作用于AIF-2、cMyc等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)與細胞增殖、分化相關的基因表達[9]。其中最早發(fā)現(xiàn)的Ras-Raf-MAPK經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導途徑是ERK1/2信號通路，ERK1、ERK2、ERK3、ERK4和ERK5是它的5個亞組，其中ERK1和ERK2是2個高度同源的亞類，它們的分子質(zhì)量分別是44 kDa和42 kDa，它們在增殖過程中起著重要作用，卻在分化過程中作用不明顯[10]。Raf家族屬于促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK），當Raf被激活，其后使MEK1/2磷酸化，最終磷酸化激活ERK1/2。被激活的ERK1/2轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，引起細胞生長、增殖與分化。

JNK、p38 MAPK通路是細胞應激反應誘導細胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導途徑。p38的信號傳遞通路是通過4種激酶構成的反應鏈。當細胞受體接收到刺激后，會激活細胞膜上的受體，通過蛋白的磷酸化作用調(diào)節(jié)p38的蛋白表達，進而使細胞外的信號傳遞到細胞核內(nèi)靶向目標，通過調(diào)節(jié)相關基因蛋白的表達影響正常細胞的代謝[11，12]。JNK家族包含有3種基因編碼，分別為JNK1、JNK2和JNK3。細胞因子、應激反應等細胞內(nèi)或者細胞外的刺激都能使JNK信號通路活化[13]。JNK信號傳導通路的具體激活過程機制非常復雜，并且其與ERK和p38等信號通路也有著相互的作用和密切的聯(lián)系，是機體中細胞代謝過程的一個必不可少的重要調(diào)節(jié)點。Yoon等[14]研究腫瘤壞死因子α（TNF-α）作用于機體軟骨細胞時發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞的代謝過程中JNK信號通路是必不可少的一個調(diào)控環(huán)節(jié)?？梢姡琂NK信號通路在細胞的代謝過程中起著重要的作用，影響著細胞的生成與凋亡。

糖皮質(zhì)激素為現(xiàn)代醫(yī)學名稱，歸屬中醫(yī)“藥邪”的范疇，為“純陽”之品，易損傷腎陰腎精[15]。大劑量或長期服用糖皮質(zhì)激素而致肝脾腎等臟器受損，肝腎不足，脾失健運，聚濕生痰，痰濕蘊結(jié)，流注關節(jié)，膠著粘滯，日久則痰瘀互結(jié)，阻于骨骸、經(jīng)脈，筋骨失榮，骨肉不相親，乃至骨枯髓空，發(fā)為SANFH。故本病病機為肝脾腎三臟虧虛為本，痰瘀互結(jié)為標[16]。本院的院內(nèi)制劑川骨片中續(xù)斷、骨碎補、熟地黃、枸杞、杜仲、淫羊霍、補骨脂填精益髓，黃芪、白術、茯苓等補氣健脾，當歸、紅花、乳香、沒藥、丹參、牛膝等活血補血。全方起到填精益血、祛瘀通絡、氣血同治、調(diào)營和衛(wèi)、攻補兼施之功效，攻不伐正，補不滋膩，骨絡疏通，使股骨頭得到氣血滋養(yǎng)。其臨床治療SANFH取得了顯著的療效。有研究表明，仙靈骨葆膠囊可通過上調(diào)血清護骨素（OPG）的表達、下調(diào)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達，提高OPG/RANKL比例，進而改善骨代謝[17]，為SANFH的治療提供了有效的方法。故本研究以仙靈骨葆膠囊為陽性對照藥。

本實驗研究結(jié)果顯示，川骨片、仙靈骨葆膠囊治療組家兔股骨頭光鏡鏡檢報告及股骨空骨陷窩率均較模型組明顯改善。川骨片、仙靈骨葆膠囊治療組家兔股骨頭組織p-ERK1/2蛋白表達有顯著升高（P＜0.05），p-JNK、p-p38蛋白表達顯著降低（P＜0.05），但川骨片治療組p-ERK1/2、p-JNK、p-p38與仙靈骨葆膠囊治療組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。推測川骨片可能是通過上調(diào)SANFH家兔股骨頭組織ERK1/2的表達，下調(diào)JNK、p38的表達，從而促進新骨的形成，抑制骨的破壞，促進骨壞死的修復，達到治療SANFH的目的。