腦缺血再灌注與神經(jīng)保護(hù)劑聯(lián)合治療腦卒中的研究進(jìn)展

孫俊，姜其慧，張陸勇，龐濤

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院 新藥篩選中心 江蘇省新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

急性缺血性腦卒中目前仍是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致患該疾病患者突發(fā)死亡的主要病因，也是成年人身體殘疾的主要原因[1]。對(duì)腦缺血患者在發(fā)病初期應(yīng)給予積極的治療，可阻止腦缺血的進(jìn)一步加重，減輕對(duì)腦組織的損傷。1995年靜脈溶栓療法最初引入時(shí)進(jìn)展緩慢，隨后的血管內(nèi)血栓切除術(shù)在大血管閉塞（large vessel occlusion，LVO）治療中取得了巨大進(jìn)展[2]。但即使在高度有效的再灌注治療后，許多患者仍存在嚴(yán)重殘疾、身體各方面的功能獨(dú)立性較差等問(wèn)題。神經(jīng)保護(hù)劑可以減小缺血后腦梗死體積而不引發(fā)出血，保護(hù)大腦免受再灌注損傷[3]。目前神經(jīng)保護(hù)劑有2種使用辦法：一種是在缺血性腦卒中發(fā)作早期給予治療，以潛在地延長(zhǎng)靜脈或動(dòng)脈內(nèi)的治療時(shí)間窗；另一種是在部分或完全再灌注期間或之后使用，以減少再灌注的損傷，進(jìn)而降低腦卒中患者在治療后殘疾的可能[4]。本文簡(jiǎn)要概括近年來(lái)對(duì)于神經(jīng)保護(hù)劑的研究進(jìn)展，分析了目前神經(jīng)保護(hù)劑研究應(yīng)用失敗的原因，討論神經(jīng)保護(hù)劑臨床前和臨床試驗(yàn)的研究方法，以期未來(lái)其能夠在腦卒中治療中發(fā)揮更大的作用。

1 腦卒中再灌注治療

1.1 腦卒中再灌注治療最新進(jìn)展

既往研究表明，急性缺血性腦卒中患者缺血核心是由不可逆轉(zhuǎn)的梗死組織組成，周圍是半暗帶即功能受損但可挽救的組織[5]。急性腦卒中后，隨著時(shí)間的推移，缺血核心可能擴(kuò)展到半暗帶，進(jìn)一步發(fā)生梗死，但如果缺血組織能夠得到較早、有效的再灌注，這個(gè)過(guò)程可能會(huì)中止。根據(jù)患者側(cè)支血流容量和缺血耐受性的差異，缺血核心的擴(kuò)大在不同的個(gè)體間可以按不同的速率進(jìn)行。因此，側(cè)支血流較差、LVO后缺血耐受性較低的患者，在發(fā)病后不久即出現(xiàn)較大的缺血中心，這些患者被稱為快進(jìn)展患者[6]，這些患者的臨床結(jié)果往往更糟，癥狀更嚴(yán)重，腦梗死體積更大，惡性腦水腫和出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)更高。相反，在卒中發(fā)生LVO后幾天內(nèi)，還具有良好的側(cè)支血流和缺血耐受性的患者往往出現(xiàn)較小的缺血核心，治療效果更理想，這些患者為慢進(jìn)展患者[7]，他們?cè)谠俟嘧⒅委熀笸ǔ?huì)有相對(duì)較好的臨床結(jié)果。

幾個(gè)缺血性腦卒中治療的隨機(jī)臨床試驗(yàn)已證實(shí)，LVO再灌注可以明顯改善腦缺血嚴(yán)重患者的臨床結(jié)果，且這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一個(gè)明顯趨勢(shì)，即更快和更完整的動(dòng)脈再灌注與較好的治療效果呈正相關(guān)（見(jiàn)表1）。

表1 腦卒中再灌注治療進(jìn)展的關(guān)鍵臨床試驗(yàn)Figure 1 Key clinical trials in the development of stroke reperfusion therapy

1.2 腦卒中再灌注治療的缺陷

盡管再灌注治療已成功實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，但只能在一定程度上改善患者的臨床癥狀。在靜脈注射tPA聯(lián)合血管內(nèi)血栓切除術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)干預(yù)下，仍有大量LVO患者出現(xiàn)嚴(yán)重殘疾，且可能伴隨溶栓后顱內(nèi)出血等并發(fā)癥。2015年對(duì)腦卒中血管內(nèi)治療成功的5項(xiàng)試驗(yàn)進(jìn)行meta分析發(fā)現(xiàn)，18.5% ～ 32.5%的卒中患者在發(fā)病后3 ～ 8 h內(nèi)可獲得成功再灌注，但在90 d內(nèi)仍有嚴(yán)重的殘疾或死亡發(fā)生[14]。在延遲再灌注治療的臨床半暗帶分診覺(jué)醒卒中及遲發(fā)型卒中患者應(yīng)用Trevo裝置行取栓治療（DAWN）研究和影像評(píng)估篩選缺血性卒中患者血管內(nèi)治療研究3（DEFUSE 3）試驗(yàn)中，分別有84%和76%的患者獲得了成功再灌注，但只有49%和45%的患者實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期自主生活功能獨(dú)立[15-16]。這些數(shù)據(jù)表明，部分卒中患者對(duì)最初成功的再灌注反應(yīng)較差，即單獨(dú)的再灌注治療不能有效地改善其臨床結(jié)果。

1.3 腦卒中再灌注治療的改善

雖然腦卒中再灌注治療在理想情況下是有效的，但其在現(xiàn)實(shí)中的有效性仍然不佳，因?yàn)榇蠖鄶?shù)腦卒中患者缺乏及時(shí)的靜脈溶栓及血管內(nèi)治療。一般人群中25%的急性缺血性腦卒中是LVO造成[17]，而大部分是遠(yuǎn)端動(dòng)脈分支閉塞或小血管閉塞的非LVO患者，由于他們?nèi)狈皶r(shí)的再灌注治療，這些患者臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)間會(huì)延遲超過(guò)4.5 h，這一現(xiàn)狀表明再灌注治療應(yīng)輔助神經(jīng)保護(hù)劑，以保護(hù)缺血半暗帶腦組織，延遲組織梗死，緩解缺血后的細(xì)胞損害，防止出血轉(zhuǎn)化，以期有效延長(zhǎng)再灌注治療的時(shí)間窗。

2 治療缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)劑

雖然靜脈溶栓及機(jī)械取栓療法是目前治療早期缺血性腦卒中的主要方法，但其時(shí)間窗及適用范圍均較窄（靜脈溶栓治療適應(yīng)證：缺血性腦卒中患者的年齡80歲且發(fā)病時(shí)間4.5 h，或年齡 ＞80歲且發(fā)病時(shí)間3 h；機(jī)械取栓治療適應(yīng)證：缺血性腦卒中患者的發(fā)病時(shí)間6 h）[18]。研究表明，缺血后神經(jīng)保護(hù)治療可以顯著延長(zhǎng)靜脈溶栓治療的時(shí)間窗[19]。神經(jīng)保護(hù)治療的主要作用方式是緩解缺血后的細(xì)胞損害，能夠有效延長(zhǎng)治療時(shí)間窗。常用的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑有鈣離子通道阻滯劑、興奮性氨基酸受體拮抗藥、抗氧化劑、抗炎免疫調(diào)節(jié)劑、凋亡抑制劑及其他類。

2.1 鈣離子通道阻滯劑

腦卒中發(fā)生后，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）能量耗竭，導(dǎo)致鈉-鉀ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)外K+濃度改變，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，Na+-Ca2+交換體使得細(xì)胞外Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)貯存的Ca2+超載。同時(shí)，腦卒中后激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA）受體，使得電壓門控Ca2+通道開(kāi)放，細(xì)胞外的Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步增加Ca2+超載。過(guò)量的Ca2+會(huì)激活分解生物膜結(jié)構(gòu)的蛋白酶，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且線粒體攝入過(guò)量的Ca2+會(huì)引起膜電位紊亂，線粒體發(fā)生凋亡，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

鈣離子通道阻滯劑通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流不僅可以減少神經(jīng)元突觸前膜興奮性氨基酸的釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而且可使腦血管擴(kuò)張、腦血流量增加，在缺血性腦卒中的治療中發(fā)揮重要作用。如尼莫地平（1）具有擴(kuò)血管作用，可改善微循環(huán)，對(duì)腦水腫有預(yù)防和治療作用。Horn等[20]發(fā)現(xiàn)一種分離自紅樹(shù)林真菌Xylaria的新型海洋真菌提取物xyloketal B，其可以改善氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，縮小缺氧缺血性腦損傷小鼠模型中的梗死體積，并可促進(jìn)其損傷后功能行為恢復(fù)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，xyloketal B是通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流、抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用[21]。

2.2 興奮性氨基酸受體拮抗劑

腦卒中后，腦組織供血不足，細(xì)胞內(nèi)外Ca2+失衡，神經(jīng)元發(fā)生去極化，使得興奮性氨基酸[（主要為谷氨酸（Glu）]大量合成并釋放，而突觸間隙ATP生物合成障礙，使得突觸間隙過(guò)量的Glu不能被重吸收或分解，過(guò)量的Glu作用于NMDA受體，激活Ca2+通道，進(jìn)一步引發(fā)Ca2+超載，導(dǎo)致腦組織損傷加重。興奮性氨基酸受體拮抗劑如腦苷肌肽，對(duì)于腦卒中的治愈率有明顯的提升[22]。但有研究顯示，神經(jīng)節(jié)苷脂試驗(yàn)組和安慰劑對(duì)照組的死亡率和致殘率差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。地佐環(huán)平（2）作為一種非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑，可以阻斷NMDA離子通道[24]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其可顯著縮小腦梗死體積。

2.3 抗氧化劑

2.3.1 自由基清除劑機(jī)體內(nèi)氧自由基過(guò)度生成而消除能力降低，會(huì)致體內(nèi)氧自由基堆積與活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）蓄積，從而引起神經(jīng)元損傷。腦缺血后線粒體功能發(fā)生障礙，線粒體利用氧氣生成ATP的能力喪失，當(dāng)恢復(fù)血流后，氧氣一部分轉(zhuǎn)化為氧離子，另一部分在黃嘌呤氧化酶的作用下生成OH-，氧離子和OH-引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，致使多種脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，最終導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞造成損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。自由基清除劑理論上可阻斷該惡性循環(huán)，對(duì)神經(jīng)起到保護(hù)作用。例如依達(dá)拉奉（3）可清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，還可以維護(hù)血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的完整性，阻止炎癥細(xì)胞的侵入。有研究表明，與安慰劑對(duì)照組相比，給藥試驗(yàn)組（對(duì)急性缺血性腦卒中患者輸注依達(dá)拉奉30 mg，每日2次，持續(xù)14 d）的神經(jīng)功能得到了很大的改善[25]。吡喃酮、卡唑生物堿這些生物堿是從黃皮果中提取的天然產(chǎn)物 claulansine F衍生而來(lái)，衍生物中的10a、7c和11a分子亞型在體外過(guò)氧化氫處理細(xì)胞模型和OGD細(xì)胞模型中均表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[26]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferatoractivated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）已被證明可作為氧化代謝的有效調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)，ZLN005為一種可以激活PGC-1α的小分子，其對(duì)OGD或體內(nèi)外缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有很好的保護(hù)作用[27]；totarol（4）可通過(guò)增加蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)，進(jìn)而增加谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，減少氧化應(yīng)激，從而預(yù)防缺血性腦卒中的發(fā)生[28]。研究還發(fā)現(xiàn)，一種新型糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抑制劑YQ138（5）在體內(nèi)和體外均可通過(guò)激活核因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路來(lái)防止Glu和腦缺血引起的神經(jīng)元損傷[29]。

2.3.2 一氧化氮合酶抑制劑機(jī)體內(nèi)有3種一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），分別為神經(jīng)元型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）。不同的細(xì)胞在不同亞型的NOS催化下，生成的NO對(duì)于腦組織損傷作用不同。nNOS主要作用于缺血早期損傷；eNOS可促進(jìn)血管舒張，增加腦血流量，對(duì)腦卒中有保護(hù)作用；iNOS主要在腦卒中晚期，可誘導(dǎo)大量NO生成，造成腦損傷。NO是缺血性腦卒中后引起病理?yè)p傷的活性氮簇，主要由iNOS催化生成。NO在細(xì)胞內(nèi)有多重?fù)p傷作用，它可以通過(guò)超氧化產(chǎn)生亞硝酸鹽，破壞線粒體并產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此，使用NOS抑制劑對(duì)于腦卒中患者的神經(jīng)細(xì)胞可以起到一定的保護(hù)作用。例如丹酚酸A（6）通過(guò)抑制NOS的表達(dá)和過(guò)氧亞硝基的形成，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[30]。

2.3.3 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制劑還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶系統(tǒng)是ROS的重要生成來(lái)源。正常情況下，大多數(shù)細(xì)胞的NADPH氧化酶處于低表達(dá)狀態(tài)；腦缺血后，NADPH氧化酶系統(tǒng)激活，機(jī)體正常氧化還原動(dòng)態(tài)失衡，ROS過(guò)量產(chǎn)生使得多種生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸被破壞，引起細(xì)胞凋亡。因此，抑制NADPH氧化酶對(duì)于腦卒中患者具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，如抗氧化劑二苯基碘（diphenylene iodonium，DPI，7）可通過(guò)阻斷NADPH氧化酶，以保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞免受腦卒中的影響[31]。

2.4 抗炎免疫調(diào)節(jié)劑

免疫炎性反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。腦缺血再灌注損傷時(shí)，氧自由基等信號(hào)分子可激活小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，使白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)上調(diào)，中性粒細(xì)胞向微血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)和黏附并可進(jìn)入腦內(nèi)，外周血中炎性細(xì)胞聯(lián)合小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子，從而加重腦損傷。因此，對(duì)于腦卒中患者使用一定的抗炎免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)于再灌注后腦神經(jīng)保護(hù)具有十分重要的意義。目前的抗炎與免疫調(diào)節(jié)藥物有：1）茶黃素（thea flavins，TF1，8），阻斷炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生以及環(huán)氧化物酶和NOS等的表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注損傷模型有明顯的保護(hù)作用[32]； 2）鹽酸吡格列酮（9），為氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）激動(dòng)劑，可以減少全身炎癥反應(yīng)，降低卒中風(fēng)險(xiǎn)[33]；3）米諾環(huán)素（10），是一種具有挑戰(zhàn)性的抗炎藥物，其化學(xué)穩(wěn)定性不強(qiáng)，但可進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，Sharma等[34]研究發(fā)現(xiàn)了一種米諾環(huán)素綴合物（D-mino），其在脂多糖（LPS）激活的小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有抗炎和抗氧化活性，D-mino綴合物由于其攝取快速，可抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和通過(guò)抑制NO產(chǎn)生降低氧化應(yīng)激，從而增強(qiáng)了藥物的細(xì)胞內(nèi)可用性，所有這些特點(diǎn)均顯著優(yōu)于游離藥物；另外，D-mino的增強(qiáng)功效可以為靶向藥物遞送治療神經(jīng)損傷提供新的機(jī)會(huì)。

筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物(+)-balasubramide的衍生物——化合物3C（11）在體外表現(xiàn)出明顯的抗神經(jīng)炎癥作用；通過(guò)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的調(diào)控，確定化合物3C在腦缺血后具有神經(jīng)保護(hù)作用；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，化合物3C在LPS刺激的BV2細(xì)胞和小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中可促進(jìn)抗炎介質(zhì)表達(dá)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，化合物3C可顯著縮小大鼠腦梗死體積，改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損[35]?；衔?C的抗炎機(jī)制為：1）通過(guò)激活磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）或AMPK上游的鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKKβ），從而發(fā)揮抗炎作用；2）通過(guò)增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體，促使PGC-1α活化，促進(jìn)抗炎介質(zhì)的生成，從而起到腦神經(jīng)保護(hù)作用。

2.5 凋亡抑制劑

造成腦卒中神經(jīng)元損傷的主要原因之一是細(xì)胞凋亡。參與缺血相關(guān)細(xì)胞凋亡因子有Caspase蛋白酶家族、AMPK、p53、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factorκ-gene binding，NF-κB）等。因而細(xì)胞凋亡抑制劑如二甲雙胍（12）在腦缺血的情況下可通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[36]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，黃芩苷（13）可通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路，從而保護(hù)缺氧缺血性新生小鼠免于腦損傷[37]。

2.6 其他類

Hurtado等[38]利用成年雄性大鼠局部腦缺血模型，在缺血造模前腹腔注射給予胞二磷膽堿（14），結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加（0.5、1和2 g · kg-1），缺血后大鼠腦組織梗死體積逐漸縮小，化合物14可以縮小梗死面積，降低神經(jīng)功能缺陷。一項(xiàng)meta分析結(jié)果也顯示，胞二磷膽堿可以改善缺血性腦卒中患者出院時(shí)的神經(jīng)功能[39]。雖然研究發(fā)現(xiàn)胞二磷膽堿對(duì)治療腦卒中有明顯的效果，但其治療機(jī)制尚未明確，多推測(cè)可能與胞二磷膽堿可以合成卵磷脂，而卵磷脂是合成細(xì)胞膜的重要成分有關(guān)。神經(jīng)節(jié)苷脂是在國(guó)內(nèi)廣泛使用的一種促神經(jīng)發(fā)生劑，在腦中含量豐富，其可參與突觸的發(fā)生過(guò)程，激活酪氨酸激酶受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平衡，降低活性氧自由基的產(chǎn)生，具有保護(hù)細(xì)胞膜、恢復(fù)神經(jīng)功能等作用。一項(xiàng)關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂輔助治療腦梗死療效的meta分析表明，在腦卒中的常規(guī)治療上加神經(jīng)節(jié)苷脂有很好的療效[40]。最近，越來(lái)越多的研究者認(rèn)為，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是預(yù)防腦卒中的重要因素[41]，因此蛋白水解物得到了越來(lái)越多的關(guān)注。腦蛋白水解物是由動(dòng)物腦組織蛋白通過(guò)酶水解獲得的一種物質(zhì)，它是由多種小分子肽和具有生物活性的特異性氨基酸組成，以各種方式作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可保護(hù)神經(jīng)元，提高記憶力、注意力和警惕性。此外，許多老年人尤其是亞洲國(guó)家的老年人更喜歡食用植物衍生肽，高纖維食物也可以降低腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[42]。Wattanathorn等[43]研究表明，腰果衍生的蛋白水解物對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其也可以作為防止腦卒中的潛在保護(hù)劑，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。

3 神經(jīng)保護(hù)劑早期臨床試驗(yàn)失敗的原因

近20年來(lái)，急性缺血性腦卒中臨床前研究的數(shù)量、廣度和深度均顯著增加[44]。最近已在臨床前動(dòng)物模型中確定了大量的神經(jīng)保護(hù)劑可以減少急性缺血性腦損傷。1990—1994年，全球平均每年有25篇文章評(píng)估急性缺血性腦卒中動(dòng)物模型中神經(jīng)保護(hù)劑的作用；2000—2004年間增長(zhǎng)了3倍（每年平均77篇），在2010年之后增長(zhǎng)了近6倍（平均每年144篇），而在1990—1994年，針對(duì)缺血性腦卒中治療，在500項(xiàng)臨床試驗(yàn)中約包括200種神經(jīng)保護(hù)候選藥物開(kāi)始進(jìn)行研究，其中350項(xiàng)試驗(yàn)于2018年2月28日前已經(jīng)完成（數(shù)據(jù)來(lái)源于www.clinicaltrials.gov）。但在200名接受神經(jīng)保護(hù)劑治療試驗(yàn)的患者中，只有9名患者在有臨床前研究的基礎(chǔ)下成功轉(zhuǎn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)[45]。這表明在腦卒中臨床試驗(yàn)中，很少有神經(jīng)保護(hù)劑能達(dá)到預(yù)期的臨床效果。神經(jīng)保護(hù)劑在早期臨床試驗(yàn)失敗的原因主要為臨床前和臨床研究因素不匹配。為了找出臨床前試驗(yàn)與臨床腦卒中研究之間的差異，一項(xiàng)研究分析了1990年1月1日到2018年2月28日在PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的關(guān)于缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)劑的所有臨床前研究[46]，最終確定了PubMed上的3 943篇文獻(xiàn)和Web of Science上的6 749篇文獻(xiàn)，研究結(jié)果顯示臨床前與臨床研究因素不匹配可能導(dǎo)致臨床試驗(yàn)的失敗。臨床人群的5個(gè)主要特征在大多數(shù)臨床前研究模型中沒(méi)有被考慮（見(jiàn)圖1）。

3.1 臨床前研究與臨床試驗(yàn)中缺血模型差異

目前，神經(jīng)保護(hù)劑的臨床前研究疾病模型大多數(shù)是針對(duì)短暫性缺血模型[46]。短暫性缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯ǔＴ谛∈笾谐掷m(xù)1 h或在大鼠中持續(xù)1.5 ～2 h。在這些時(shí)間范圍內(nèi)使用重組人組織型纖溶酶原激活物阿替普酶（alteplase，rt-pa）和血管內(nèi)治療的臨床試驗(yàn)患者中，同時(shí)使用神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)于治療成功的可能性更大。研究顯示，永久性缺血模型的神經(jīng)保護(hù)劑治療效果通常比暫時(shí)性缺血模型差[47]，因此臨床前研究也認(rèn)為神經(jīng)保護(hù)劑發(fā)揮療效需要依賴于再灌注治療。觀察進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的10種神經(jīng)保護(hù)劑在短暫性和永久性缺血臨床前動(dòng)物模型中的作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這10種神經(jīng)保護(hù)劑只在短暫性缺血模型中有積極作用，而在永久性模型中并未顯示有明顯作用[46]。因此，血管內(nèi)充分的再灌注治療為神經(jīng)保護(hù)療法提供了機(jī)會(huì)，腦卒中的主要治療目標(biāo)應(yīng)針對(duì)于缺血半暗帶，而再灌注恢復(fù)血流可以促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)劑向缺血性半暗帶輸送，進(jìn)一步保護(hù)缺血半暗帶損傷的細(xì)胞[48]。缺血性卒中后再灌注的療效不僅取決于閉塞血管的再通，還取決于側(cè)支循環(huán)的固有特性，梗死核心附近的側(cè)支循環(huán)可能在血管閉塞后被激活，為損傷的周圍組織提供缺失的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，因此，側(cè)支血流通暢情況可影響預(yù)后。

圖1 缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)劑的研究選擇流程圖Figure 1 Study selection flow chart of neuroprotective agents for ischemic stroke

3.2 臨床前研究與臨床試驗(yàn)治療效果評(píng)估差異

臨床前研究多以梗死體積評(píng)估，臨床試驗(yàn)多以長(zhǎng)期神經(jīng)功能狀態(tài)評(píng)估。70%的臨床前研究將梗死體積作為評(píng)價(jià)治療效果的單一標(biāo)準(zhǔn)，而臨床治療效果主要是基于改良Rankin量表[49-50]用于評(píng)估長(zhǎng)期神經(jīng)功能狀態(tài)。在一部分受試者中的研究顯示，臨床癥狀的嚴(yán)重程度與梗死體積之間并無(wú)直接相關(guān)性[51]，這表明在臨床前研究中不能將梗死體積作為單一評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。綜合分析顯示，2 489項(xiàng)臨床前研究中只有819項(xiàng)評(píng)估了卒中動(dòng)物的神經(jīng)功能結(jié)果，而在這819項(xiàng)研究中只有不到30%的研究在較長(zhǎng)時(shí)間（此處定義為＞ 14 d）監(jiān)測(cè)了神經(jīng)功能狀態(tài)[46]；在這些臨床前研究中顯示，大多數(shù)神經(jīng)保護(hù)劑可以促進(jìn)長(zhǎng)期神經(jīng)功能恢復(fù)，但均未進(jìn)行過(guò)臨床試驗(yàn)。究其原因可能是：動(dòng)物研究和人體研究之間存在巨大差異；腦卒中在不同人群中發(fā)病亦存在差異；治療時(shí)間窗不同以及神經(jīng)保護(hù)劑的不良反應(yīng)亦不同；腦缺血損傷機(jī)制復(fù)雜，單一的神經(jīng)保護(hù)劑不能起到很好的效果。因此，在臨床前研究中對(duì)長(zhǎng)期神經(jīng)功能恢復(fù)取得改善作用的神經(jīng)保護(hù)劑，對(duì)其進(jìn)行臨床試驗(yàn)并深入研究是有必要的。

3.3 臨床前研究與臨床試驗(yàn)研究對(duì)象年齡與性別差異

臨床前研究模型主要使用年輕動(dòng)物，而在臨床患者常見(jiàn)于老年患者。眾所周知，人類腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡的增長(zhǎng)而急劇上升[52]。臨床前研究表明，發(fā)生短暫性腦動(dòng)脈閉塞的青年大鼠死亡率為6.3%，老年大鼠死亡率為43.5%[53]。臨床前研究在超過(guò)2 000種治療方法中，只有2種治療方法[3K3A激 活 蛋 白 C（3K3A-activated protein C，3K3AAPC）[54]和氯化鎂[55]]在老年嚙齒動(dòng)物（3K3A-APC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠，氯化鎂為大鼠）永久性缺血模型中進(jìn)行評(píng)估，并發(fā)現(xiàn)缺血損傷后老年大鼠神經(jīng)功能損害隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而愈發(fā)嚴(yán)重[56]。美國(guó)心臟協(xié)會(huì)最近一份報(bào)告顯示，65 ～ 74歲缺血性腦卒中患者的30 d內(nèi)死亡率為9.0%，74 ～ 84歲為13.1%，85歲及以上為23.0%[57]。美國(guó)國(guó)家神經(jīng)紊亂和卒中研究所報(bào)告稱，每年卒中的女性患者比男性多5.5萬(wàn)人，女性在年輕時(shí)缺血性腦卒中發(fā)病率低于男性，但在85歲之后反而高于男性，且女性腦卒中后的死亡率、致殘率更高[58]。在臨床前研究中，年輕雌性嚙齒類動(dòng)物在缺血性腦卒中后腦部損傷程度比年輕雄性嚙齒類動(dòng)物小[59]，因?yàn)轭惞檀技に厝绱萍に睾忘S體酮，是缺血性腦卒中后潛在的神經(jīng)保護(hù)因子[60]。因此，考慮到年齡及性別差異，有必要分別評(píng)估用于老年男性和女性的神經(jīng)保護(hù)劑。

3.4 臨床前研究與臨床試驗(yàn)研究對(duì)象共患病差異

臨床卒中患者常伴多種其他疾病。大約72%的缺血性腦卒中發(fā)生在65歲以上的患者身上[61]。在這一老年人群中往往存在著其他慢性疾病，包括高血壓和糖尿病等，且其可能影響神經(jīng)保護(hù)劑的療效[62]。腦卒中研究評(píng)估發(fā)現(xiàn)，90%的缺血性腦卒中是由包括高血壓、糖尿病、高濃度酒精攝入、吸煙習(xí)慣、不良飲食選擇、肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、心理社會(huì)壓力、心臟疾病和脂質(zhì)異常等10個(gè)已知的危險(xiǎn)因素引起的[63]。但絕大多數(shù)臨床前腦卒中研究對(duì)象均是建立在最佳無(wú)病原條件下飼養(yǎng)的年輕健康嚙齒類動(dòng)物模型中進(jìn)行的，因此嘗試設(shè)計(jì)包括糖尿病和高血壓等常見(jiàn)共患病的動(dòng)物模型，再在這些模型中進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)劑的效果評(píng)估可能更準(zhǔn)確[64]。 然而，鑒于共患病的復(fù)雜性，應(yīng)要求腦卒中實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭缓w多種疾病的單一方面，確保在特定共患病的多個(gè)獨(dú)立模型中有效，這樣可能增加臨床試驗(yàn)成功的可能性。

3.5 臨床前和臨床研究中的發(fā)表偏倚

中性或消極的結(jié)果很難在同行評(píng)議期刊上發(fā)表，這會(huì)在臨床前和臨床研究中引入發(fā)表偏見(jiàn)，從而影響報(bào)告中得出結(jié)論的真實(shí)性。研究發(fā)現(xiàn)，95%符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究均能在臨床前模型中獲得積極的結(jié)果[46]，這種只報(bào)告正面結(jié)果的傾向?qū)?huì)導(dǎo)致臨床前和臨床研究的發(fā)表偏移，造成研究結(jié)果不真實(shí)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上，腦卒中治療的主要目標(biāo)是提高缺血性卒中早期再通率，應(yīng)探索新型溶栓藥物以提高缺血性腦卒中患者再通率，降低出血風(fēng)險(xiǎn)。改進(jìn)機(jī)械溶栓技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)LVO再通，而且可獲得最大程度的小血管再灌注。同時(shí)，應(yīng)尋找保護(hù)血腦屏障并保持其完整性的藥物，腦缺血后，其可以保護(hù)BBB功能，抑制水和促炎細(xì)胞因子進(jìn)入大腦，最終減輕再灌注損傷?；趶V泛的文獻(xiàn)分析，神經(jīng)保護(hù)劑與溶栓藥物或血管內(nèi)血栓切除術(shù)的結(jié)合應(yīng)作為治療急性缺血性卒中的新策略。目前，神經(jīng)保護(hù)劑在臨床研究未能成功為臨床試驗(yàn)失敗的原因：1）在患者方面，未將神經(jīng)保護(hù)劑候選分子與快速、豐富的再灌注結(jié)合治療。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，過(guò)多應(yīng)用短暫腦卒中模型，而未使用永久性腦卒中模型。2）缺乏臨床前研究分析治療效果與長(zhǎng)期神經(jīng)功能。3）使用健康的成年雄性動(dòng)物替代患有糖尿病和其他疾病的老年雄性和雌性動(dòng)物。4）與大型臨床試驗(yàn)相比，臨床前研究文章傾向于報(bào)告有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的積極結(jié)果。因此，鼓勵(lì)臨床前研究使用雌性動(dòng)物、老年動(dòng)物，評(píng)估長(zhǎng)期神經(jīng)功能結(jié)果，并增加嚴(yán)格、權(quán)威性的分析和適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)性數(shù)據(jù)[65]，且鼓勵(lì)臨床前永久性腦卒中模型的建立，這些高要求可以加速臨床前向臨床研究的轉(zhuǎn)化，給生物醫(yī)學(xué)帶來(lái)回報(bào)，也為未來(lái)腦卒中患者帶來(lái)更多的福音。