濃香型白酒酒醅風(fēng)味物質(zhì)和微生物菌群結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律

高江婧，任聰，劉國英，葛向陽，王慧琳，葉方平，徐巖*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫，214122) 2(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236820) 3(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

在濃香型白酒釀造生產(chǎn)實踐中，通常采用“雙輪底發(fā)酵工藝”來提高酒質(zhì)，雙輪底糟發(fā)酵實質(zhì)是延長發(fā)酵期的一種工藝方法[1-2]。受夏季氣溫過高因素的影響，酒醅發(fā)酵溫度較難控制，很多名優(yōu)酒廠采取暫停生產(chǎn)措施以安全度夏，這勢必會造成酒醅發(fā)酵周期的延長。而長期的生產(chǎn)經(jīng)驗表明，延長酒醅發(fā)酵時間后，所釀造出的濃香型原酒品質(zhì)更佳。

近年來，國內(nèi)學(xué)者逐步重視對濃香型白酒酒醅中的微生物菌群演替規(guī)律進行解析。多數(shù)研究表明，在發(fā)酵過程中，酒醅中的乳酸菌成為絕對優(yōu)勢菌群，乳酸菌在發(fā)酵初期快速繁殖，發(fā)酵中后期相對豐度呈緩慢上升趨勢[3-5]；劉凡等[6]通過宏基因組測序解析了濃香型白酒發(fā)酵過程中的微生物與主要有機酸合成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)窖內(nèi)發(fā)酵初期(0～14 d)與主要有機酸(乳酸、乙酸、丁酸和己酸)合成相關(guān)的微生物數(shù)量顯著高于發(fā)酵后期(15～60 d)。上述有關(guān)酒醅微生物菌群的研究均針對的是2個月的常用發(fā)酵周期，尚未揭示出延長發(fā)酵時間后窖內(nèi)酒醅微生物菌群和風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律。

窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，目前對窖泥的微生物菌群結(jié)構(gòu)認識逐步清晰，研究發(fā)現(xiàn)地域、窖齡、窖內(nèi)分布位置、窖泥質(zhì)量均對窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)具有較大的影響，如新窖泥以乳桿菌為主，而老窖泥以梭菌綱、擬桿菌綱和產(chǎn)甲烷菌為主[7-12]。王雪山等[13]分析了濃香型酒醅微生物的來源，發(fā)現(xiàn)大曲是酒醅中好氧和兼性厭氧菌的主要來源(占比74%)，而窖泥是酒醅厭氧菌群的主要來源(占比14%)，但窖泥微生物菌群對酒醅微生物菌動態(tài)變化的影響卻鮮有研究。另一方面，濃香型白酒發(fā)酵窖池深達2 m，對發(fā)酵過程酒醅取樣，尤其是對底層酒醅取樣困難，發(fā)酵后期較多的黃水也對酒醅取樣造成困難，目前尚缺少對濃香型白酒發(fā)酵窖池底層酒醅中微生物與風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生動態(tài)規(guī)律的長發(fā)酵周期追蹤研究。本文跟蹤了發(fā)酵周期長達5個月的窖池，并重點關(guān)注了窖池下層酒醅中的主要風(fēng)味物質(zhì)和微生物菌群的變化規(guī)律，為解析延長發(fā)酵時間與原酒品質(zhì)關(guān)系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

在濃香型白酒釀造車間，選取正常生產(chǎn)班組的2口老窖池，窖齡均為27年。采用自制酒醅取樣器分別取樣不同發(fā)酵時間點的酒醅樣本，連續(xù)跟蹤取樣直至156 d發(fā)酵結(jié)束。本文取樣的酒醅樣本均為窖池下部的酒醅。發(fā)酵結(jié)束后，采用五點取樣法取窖泥100 g并混合均勻。酒醅和窖泥樣本均凍存于-20℃冰箱待用。

1.2 主要試劑

己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、乳酸、丁酸、己酸、叔戊醇、乙酸正戊酯和2-乙基丁酸等標(biāo)準品(色譜純)：購于美國Sigma-Aldrich試劑公司；無水乙醇(色譜純)：購于上海安譜公司；DNA提取試劑盒：購于美國Qiagen公司。

1.3 揮發(fā)性組分分析

稱取酒醅(窖泥)樣本10 g，加入60%的無水乙醇20 mL渦旋混勻，浸提30 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液過膜，并加入混合內(nèi)標(biāo)(叔戊醇、乙酸正戊酯和2-乙基丁酸)后進行氣相色譜分析。色譜柱為CP-wax57CB毛細管柱(50m×0.25mm×0.25μm)，氣相進樣口溫度為230℃，檢測器溫度為230℃，載氣為高純氮，流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，分流比為30∶1。程序升溫條件為：初始溫度35℃，保持0 min,以4 ℃/min升到60℃，保持4 min,再以6 ℃/min升到195 ℃，保持20 min。

1.4 乳酸分析

酒醅(窖泥)樣本用超純水浸泡離心，并經(jīng)適當(dāng)稀釋后，采用超高效液相色譜法[14]測試上清液的乳酸含量。色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)，流動相為0.02 mol/L KH2PO4，流速為0.1 mL/min，進樣量為1 μL，二極管陣列檢測器，檢測波長為208 nm。

1.5 酒醅和窖泥微生物DNA的提取

對于酒醅樣本，采用滅菌的PBS緩沖液多次提取酒醅中的微生物細胞，以去除雜質(zhì)，收集細胞沉淀，然后采用DNeasy UltraClean Microbial Kit提取酒醅微生物總基因組DNA。窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy Power-Soil Kit進行提取，提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進行。利用瓊脂糖電泳對提取的微生物DNA進行質(zhì)量檢測，合格后進行建庫、測序。

1.6 高通量測序與數(shù)據(jù)分析

建庫與測序由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。高通量測序針對細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域，擴增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′)。測序平臺為Illumina MiSeq。測序原始序列采用FLASH和Trimmomatic軟件進行拼接及質(zhì)控過濾，序列的質(zhì)檢標(biāo)準為：(1)去除序列尾部質(zhì)量值20以下的堿基，去除質(zhì)控后50 bp以下的序列；(2)引物最大錯配數(shù)為2，barcode允許的錯配數(shù)為0，去除模糊堿基；(3)最小overlap序列長度為10 bp，且拼接序列的overlap區(qū)允許最大錯配比率為0.2。采用Uchime軟件去除嵌合體序列。使用Usearch(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)將序列按照97%相似度聚類，進行OTU(operational taxonomic units，操作分類單元)劃分，提取代表序列，得到OTU表。將細菌OTU代表序列與Silva(Release132，http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫比對，進行分類學(xué)注釋。細菌菌群熱圖(heatmap)和冗余分析(redundancy analysis，RDA)通過R語言(vegan包)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅主要風(fēng)味物質(zhì)隨發(fā)酵時間的變化趨勢

在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，靠近窖池底部的下層酒醅質(zhì)量最佳，一般用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)濃香型原酒。對窖池下層酒醅的4種主要有機酸進行測試分析，結(jié)果表明乳酸含量在總酸中占有絕對優(yōu)勢(>85%)，其次是乙酸、己酸和丁酸。在整個156 d長的發(fā)酵周期內(nèi)，乳酸含量在發(fā)酵初期0 ～14 d快速增加，之后乳酸含量增速變緩，在發(fā)酵120 d后乳酸含量有略微下降的趨勢(圖1-A)。乙酸則在發(fā)酵初期0～21 d快速增加，之后略有緩慢增加趨勢。而丁酸和己酸的含量在發(fā)酵50 d后持續(xù)增加，直至發(fā)酵結(jié)束(圖1-B)。由此可知，對于較短的發(fā)酵周期(60 d以內(nèi))，酒醅中的丁酸、己酸并未大量積累，這與相關(guān)文獻的報道基本一致[6]。

與此同時，酒醅中的乳酸乙酯和乙酸乙酯兩種風(fēng)味組分與乳酸、乙酸的變化趨勢基本一致，在發(fā)酵初期，乳酸乙酯和乙酸乙酯呈現(xiàn)顯著增加趨勢，20 d后則逐漸趨于平穩(wěn)，而酒醅中己酸乙酯的含量則在長期發(fā)酵的后期迅速增加(圖1-C)，表明在濃香型白酒釀造工藝中，延長發(fā)酵周期，可以顯著提高酒醅中己酸乙酯的含量。己酸乙酯含量的提高，相應(yīng)提高了己酸乙酯與乙酸乙酯的比值，因而延長發(fā)酵時間，也有利于促進白酒中酯類物質(zhì)的平衡。

2.2 酒醅原核微生物隨發(fā)酵時間的變化趨勢

為進一步認識窖池下層酒醅在長期發(fā)酵過程中的微生物變化規(guī)律，對不同發(fā)酵時間的酒醅細菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析。酒醅16S rRNA基因測序表明，酒醅中的細菌主要以芽孢桿菌綱的乳桿菌科(Lactobacillaceae)為主，乳桿菌在整個發(fā)酵過程中占有絕對優(yōu)勢，因而乳桿菌的代謝產(chǎn)物乳酸在總酸中也占有絕對優(yōu)勢。在發(fā)酵14 d時，乳桿菌科的相對豐度達到99%以上，這與發(fā)酵初期酒醅中的乳酸含量急劇增長相對應(yīng)，表明乳桿菌科在發(fā)酵初期即大量繁殖，代謝產(chǎn)生高含量的乳酸。但隨著發(fā)酵時間的延長，乳桿菌科的相對豐度逐漸下降至85%左右(圖2)。相反，梭菌綱微生物的相對豐度則逐漸增加至8.94%。

A-乳酸；B-揮發(fā)酸；C-酯類物質(zhì)圖1 酒醅發(fā)酵過程中主要風(fēng)味物質(zhì)含量變化Fig.1 Dynamics of key flavor compounds in fermented grains during fermentation

A-綱水平;B-科水平圖2 酒醅細菌菌群隨發(fā)酵時間變化規(guī)律Fig.2 Dynamic of bacterial community in fermented grains during fermentation注：圖中數(shù)據(jù)為相同發(fā)酵時間點酒醅樣本測序結(jié)果的平均值。下同。

由于乳桿菌科在整個發(fā)酵過程中占有絕對優(yōu)勢，其相對豐度均大于80%，當(dāng)扣除乳桿菌科后，可觀測到酒醅中梭菌綱微生物的相對豐度隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)出顯著遞增趨勢。在科水平上，梭菌綱的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和梭菌科(Clostridiaceae_1)的相對豐度隨發(fā)酵時間的延長顯著增加。除乳桿菌科的相對豐度隨發(fā)酵時間延長下降外，r-變形菌綱的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)也隨發(fā)酵時間的延長而顯著降低(圖3)。

A-綱水平;B-科水平圖3 酒醅扣除乳桿菌科后的細菌菌群隨發(fā)酵時間變化規(guī)律Fig.3 Dynamic of bacterial community expect for Lactobacillaceae in fermented grains during fermentation

2.3 不同發(fā)酵時間酒醅微生物與窖泥微生物的相關(guān)性

由于窖泥是酒醅厭氧微生物菌群的重要來源，王雪山等通過微生物來源(SourceTracker)分析酒醅微生物的來源，發(fā)現(xiàn)窖泥來源厭氧菌占到酒醅原核菌群的14%[13]。將不同發(fā)酵時間的酒醅微生物與窖泥微生物的種類分別進行比較，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，酒醅與窖泥中檢測到的共有微生物種類逐漸增多，在科水平上，從發(fā)酵14 d的28個共有微生物增加至140 d的82個共有微生物(圖4)。

A-發(fā)酵14 d;B-發(fā)酵56 d；C-發(fā)酵140 d圖4 不同發(fā)酵時間酒醅與窖泥共有微生物(科水平)比較分析Fig.4 Comparison of communal microorganisms (at family level) between pit mud and fermentedgrains at different fermentation time注：FG-14d表示發(fā)酵14 d的酒醅；FG-56d表示發(fā)酵56 d的酒醅；FG-140 d表示發(fā)酵140 d的酒醅；PM表示窖泥。下同。

通過比較窖泥和不同發(fā)酵時間酒醅的微生物差異，進一步發(fā)現(xiàn)，隨發(fā)酵時間在酒醅中相對豐度逐漸升高的微生物，如瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Dysgonomonadaceae、梭菌科(Clostridiaceae_1)，這些微生物也是窖泥中的高豐度微生物，它們在窖泥中的平均相對豐度分別為24.79%、22.35%、13.01%(圖5)。表明在長期發(fā)酵過程中，窖泥為酒醅持續(xù)不斷提供其主體的厭氧微生物菌群。值得說明的是，瘤胃菌只是細菌分類學(xué)名稱，最初命名源于從牛瘤胃中發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生丁酸的某種新類型厭氧菌，而窖泥中的瘤胃菌屬于該科下的新成員，與定義該科源自于瘤胃的細菌并不是同屬細菌，它們只是在科水平上的親緣關(guān)系上較為接近。

A-菌群結(jié)構(gòu)；B-變化規(guī)律圖5 窖泥菌群結(jié)構(gòu)和對應(yīng)的酒醅菌群隨發(fā)酵時間變化規(guī)律Fig.5 The bacterial community of pit mud and dynamic of bacterial community in fermented grains during long-termfermentation注：數(shù)據(jù)為樣本測序結(jié)果的平均值，菌群為科水平。

此外，窖泥中平均相對豐度較高的一些微生物，如Rikenellaceae (9.13%)和Cloacimonadaceae(3.15%)，它們在酒醅中的相對豐度并未同比例增加，后者甚至在酒醅中檢測不到；而窖泥中平均相對豐度較低的Heliobacteriaceae(0.47%)在酒醅中的相對豐度卻較高。雖然窖池下部酒醅在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)半固態(tài)(由于原料水解和微生物的代謝活動，酒醅中的水分含量較高)，窖泥微生物可以通過遷移或擴散進入酒醅，但本文研究結(jié)果表明，從窖泥遷移至酒醅中的微生物并非是同比例增加的，酒醅的高酸高醇環(huán)境也可能影響窖泥微生物向酒醅的遷移速率和生長代謝。而與此相對的是，酒醅中雖富含有80%以上高豐度的乳桿菌，但其在窖泥中的相對豐度卻僅有1%左右，表明即使在長期的發(fā)酵過程中，酒醅中占有絕對優(yōu)勢的乳桿菌并未能大量入侵到窖泥微生物體系中，正常窖泥微生物菌群具有較好的魯棒性，能夠抵抗酒醅中乳酸菌的入侵。

2.4 風(fēng)味物質(zhì)與微生物的相關(guān)性分析

上述分析比較了不同發(fā)酵時間酒醅和發(fā)酵終點窖泥細菌菌群結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)隨發(fā)酵時間的延長，相對豐度逐漸增高的物種亦是窖泥中的主體功能菌群。為進一步分析這些微生物與發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)生成是否相關(guān)，我們進行了冗余分析(RDA)(圖6)。結(jié)果表明，乳桿菌科的相對豐度與乳酸含量呈強正相關(guān)，而丁酸、乙酸、己酸含量則與梭菌科、瘤胃菌科、Dysgonomondaceae的相對含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此，推測這些微生物對發(fā)酵后期己酸、丁酸、乙酸的合成具有重要貢獻。

圖6 微生物與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between microbes and flavor compounds

3 討論

本文對長達5個月發(fā)酵周期的窖池下層酒醅進行分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期(0～14 d)，由于乳桿菌的大量繁殖，酒醅乳酸含量迅速增加，此后乳桿菌在整個發(fā)酵過程中占有絕對優(yōu)勢。乳桿菌在發(fā)酵初期即大量繁殖，其代謝生成的高濃度乳酸抑制了無耐酸性能的微生物或有害菌的生長，避免了發(fā)酵過程受到這些微生物的污染。相對占絕對優(yōu)勢的乳桿菌而言，梭菌綱微生物占比較小，雖然梭菌綱微生物的相對豐度隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)顯著遞增趨勢，但即使到發(fā)酵140 d時，其平均相對豐度也僅占總細菌的8.94%。雖然酒醅中的梭菌綱微生物在數(shù)量上不占優(yōu)勢，但其對酒醅風(fēng)味物質(zhì)貢獻卻巨大。

任聰?shù)萚15]通過對新、老窖泥的微生物菌群結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)窖泥中的主體己酸菌為梭菌綱瘤胃菌科的己酸菌屬(Caproiciproducens)微生物，且以乳酸和葡萄糖利用型己酸菌為主。本文通過跟蹤長達5個月的發(fā)酵過程中窖池下層酒醅微生物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，梭菌綱瘤胃菌科的微生物在酒醅中的相對豐度逐漸增加，并觀測到在長期發(fā)酵的后期(120 d后)，酒醅中的乳酸含量亦有略微的下降趨勢，而丁酸、己酸含量則隨發(fā)酵期的延長持續(xù)增加。推測窖泥中的主體產(chǎn)己酸菌進入酒醅后，可將乳酸底物逐漸轉(zhuǎn)化為丁酸和己酸，從而為酯類物質(zhì)的合成不斷提供充足的前體物質(zhì)。

對酒醅菌群和窖泥菌群比較可知，酒醅中占有絕對優(yōu)勢的乳桿菌在窖泥中的相對豐度卻較低，表明即使在長達5個月的發(fā)酵過程中，酒醅中占有絕對優(yōu)勢的乳桿菌并未能入侵到窖泥微生物體系中。有研究表明，新窖池的窖泥以高含量的乳桿菌為主要特征[7, 15]，新窖池的窖泥由于厭氧菌群物種多樣性低，尚未形成穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)，推測在長時間的發(fā)酵過程中，新窖池酒醅中的乳桿菌可能會入侵至窖泥體系中。本文所取樣的酒醅和窖泥均為老窖池的樣本，老窖池的窖泥具有豐富的厭氧菌群，在長時間的酒醅發(fā)酵過程中，不僅能抵御酒醅中乳桿菌的入侵，而且老窖泥中的主體微生物能不斷遷移至酒醅層中。因此酒醅的發(fā)酵期越長，從老窖泥遷移至酒醅中的窖泥微生物越多，代謝生成的丁酸、己酸等有機酸含量也越多。

綜上所述，對于老窖池而言，延長酒醅發(fā)酵時間后，一方面，窖泥中的主體厭氧微生物不斷遷移進入酒醅，使得酒醅中的丁酸、己酸等有機酸含量持續(xù)積累；另一方面，也為有機酸與乙醇通過酯化反應(yīng)生成酯類風(fēng)味物質(zhì)提供了更為充足的時間，因而發(fā)酵后期(120 d后)，在酒醅中檢測到了己酸乙酯的大量合成。此外，己酸作為濃香型白酒重要風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯的前體物質(zhì)，其可作為衡量濃香型原酒品質(zhì)的重要指征性指標(biāo)。本文也主要對酒醅中高含量的有機酸(乳酸、乙酸、己酸、丁酸)和相應(yīng)的酯類物質(zhì)進行了分析，然而很多其他微量風(fēng)味物質(zhì)(如戊酸、辛酸、丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯等)對濃香型白酒風(fēng)格的形成也具有重要作用[16-18]，因此在長期發(fā)酵過程中，酒醅中其他微量風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律仍有待深入分析。

雖然延長酒醅發(fā)酵時間對提高酒質(zhì)有諸多優(yōu)勢，但也存在出酒率偏低、窖池周轉(zhuǎn)率偏低等問題。另外，現(xiàn)有對窖泥微生物的研究表明，窖泥中亦存在一些產(chǎn)異嗅味的微生物[19-21]，這些微生物在長期發(fā)酵過程中對原酒品質(zhì)的影響有待深入研究。