海洋藻類來(lái)源ACE IPs的酶法制備及評(píng)價(jià)模型的研究進(jìn)展

陳勝軍，蔡苗苗，楊賢慶，楊少玲，李春生

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州， 510300)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 3(江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港，222005)

目前，高血壓已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)心、腦血管疾病發(fā)病和死亡的主要危險(xiǎn)因素，常常還伴有肥胖、糖尿病及其他心、腦血管疾病等并發(fā)癥。國(guó)務(wù)院新聞辦發(fā)布的《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告(2015)》[1]內(nèi)容顯示,2012年全國(guó)18歲及以上的成人高血壓患病率達(dá)25.2%。隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高，預(yù)防和控制高血壓刻不容緩。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptides，ACE IPs)，又稱降血壓肽(antihypertensive peptides)，是一類能夠降低血壓的小分子肽的統(tǒng)稱。研究表明，降血壓肽適用于高血壓伴心肌梗死和輕度腎功能損害的患者，具有降血壓效果，且不會(huì)影響病人血糖和血脂的正常代謝[2]。其中，化學(xué)合成的降血壓肽易引發(fā)咳嗽、喉嚨腫痛等副作用，因此該類藥物的使用率降低。研究人員針對(duì)于無(wú)副作用，且不影響正常血壓的食源性降血壓肽做了大量研究。目前研究者們已在球等金鞭藻[3]、羅非魚[4]、綠豆[5]、番茄[6]、核桃[7]、面粉[8]、菜籽[9]等各類食物中制備出了降血壓肽。

與陸生食源蛋白質(zhì)不同，海洋藻類(marine algae)來(lái)源的蛋白質(zhì)具有特殊的蛋白質(zhì)組成和氨基酸序列，且海洋藻類中還富含氨基酸類、糖類等多種生物活性物質(zhì)，因此被賦予多種功能活性，如抗氧化、抗病毒、降血壓等[10-12]。全世界已知藻類有3萬(wàn)多種，可分為12門，其中有11門海生種類，目前研究利用較多的有紅藻類、褐藻類、綠藻類、藍(lán)藻類等。近年來(lái)，世界海藻養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織“2018年世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖狀況”報(bào)告指出：2016年世界海藻養(yǎng)殖總量達(dá)3 120萬(wàn)t，而我國(guó)作為海藻養(yǎng)殖大國(guó)，同年海藻養(yǎng)殖總量占世界海藻養(yǎng)殖總量的47.9%。研究表明，海洋藻類可以為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，且海藻蛋白質(zhì)中氨基酸組成良好，是制備降血壓肽的良好來(lái)源。本文對(duì)海洋藻類ACE IPs的酶法制備及其降血壓活性的評(píng)價(jià)模型進(jìn)行了綜述，以期為海洋藻類開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 作用機(jī)制

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)通過(guò)鋅離子、氫鍵和帶正電荷的殘基結(jié)合位點(diǎn)等活性位點(diǎn)作用于血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)種的血管緊張素(angiotensin，Ang)和舒緩激肽(bradykinin，BK)，最終達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體血壓的目的。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)中，腎素促進(jìn)Ang轉(zhuǎn)化為Ang Ⅰ，而ACE酶切Ang Ⅰ的C端His-Leu，使其轉(zhuǎn)化為Ang Ⅱ，刺激腎臟分泌鹽皮質(zhì)激素醛固酮，引起腎小管中K+排泄、Na+和Cl-再吸收，造成鈉儲(chǔ)留，還會(huì)引起交感神經(jīng)活動(dòng)，促使小動(dòng)脈和毛細(xì)血管平滑肌收縮，導(dǎo)致血壓升高[13]。在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)中，激肽源由激肽釋放酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)锽K，BK可促進(jìn)前列環(huán)素I2合成，舒張血管，最終起到降血壓作用[14]。然而，ACE會(huì)酶切BK的C-端Phe-Arg，使其失活為緩釋肽，導(dǎo)致KKS系統(tǒng)無(wú)法正常調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)血壓。

食源性ACE IPs被應(yīng)用于高血壓的治療中，主要是基于其可以抑制ACE的活性或使其失活，阻止Ang Ⅱ的形成，并避免BK失活，從而快速有效地使血壓降低。最常見(jiàn)的ACE IPs類型是抑制劑類，包括競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性8種抑制類型。在已有研究中，海洋藻類來(lái)源的ACE IPs大部分表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，少數(shù)表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型。有研究認(rèn)為，ACE IPs可能是通過(guò)芳香側(cè)鏈與ACE活性位點(diǎn)相結(jié)合從而抑制其活性[15]。但目前海洋藻類來(lái)源ACE IPs的相關(guān)研究較少，其對(duì)ACE活性位點(diǎn)的具體抑制原理尚不明確，有待深入研究。

2 ACE抑制肽的酶法制備

酶解法因其具有安全環(huán)保，條件溫和、高效、專一、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)而成為海洋藻類來(lái)源ACE IPs的最常用的制備方法。酶解法一般可分為單酶水解法和復(fù)合酶水解法。

2.1 單酶水解法

由于作用方式不同，蛋白酶可分為外切蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶；外切蛋白酶從肽鏈的任意一端開(kāi)始作用，酶切蛋白后產(chǎn)生單個(gè)氨基酸；內(nèi)切蛋白酶的酶切位點(diǎn)位于肽鏈內(nèi)側(cè)，作用后產(chǎn)生肽段[16]。過(guò)多游離氨基酸影響ACE抑制活性，在ACE IPs的制備中更多地選用內(nèi)切蛋白酶為商業(yè)用酶，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等。比較單酶水解海洋藻類蛋白源制備ACE IPs的相關(guān)研究，分析酶的切割位點(diǎn)及酶解產(chǎn)物活性的關(guān)系如表1所示。

堿性蛋白酶與胰蛋白酶的活性位點(diǎn)十分廣泛，作用后產(chǎn)生的肽段中C端含Pro和Tyr、Met等疏水性氨基酸，且由于胰蛋白酶的活性部位含絲氨酸殘基，通常酶切蛋白后產(chǎn)生C末端帶正電荷的氨基酸，如酶切球等金鞭藻蛋白獲得C端為L(zhǎng)ys的肽段Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys[3]。由于胃蛋白酶的活性部位含2個(gè)羧基，其特異性酶切位點(diǎn)偏向于R2為苯丙氨酸殘基的部位，其作用后產(chǎn)生的肽段的C端氨基酸為Pro或其他疏水性氨基酸，N端氨基酸為疏水性氨基酸或芳香族氨基酸。以上結(jié)構(gòu)均符合ACE IPs的結(jié)構(gòu)模型假說(shuō)[17]，該假說(shuō)認(rèn)為N端區(qū)域含疏水性氨基酸、中間部位含帶正電荷的氨基酸殘基和C端含芳香族氨基酸的肽段具有較高ACE抑制活性。也有研究認(rèn)為，N端含有疏水氨基酸，C端三肽序列中含有Trp，可能有助于提高ACE的抑制活性[18]，而MINORU等[19]使用蛋白酶S水解裙帶菜蛋白得到的4種活性較高的肽段C端氨基酸均為Trp，為該理論供了證據(jù)。

表1 海洋藻類蛋白源ACE IPsTable 1 ACE inhibitory peptides derived from marine algae proteins

注：“—”表示所引文獻(xiàn)的研究中未描述抑制類型。

原料蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)未知性和蛋白酶的酶切位點(diǎn)差異性共同造成了ACE IPs的結(jié)構(gòu)和活性的差異。一般來(lái)說(shuō)，蛋白的水解程度不同，得到的肽段長(zhǎng)短、氨基酸組成、排序方式和ACE抑制活性也不盡相同。在SAMARAKOON等[21]的研究中，采用胃蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分別水解眼點(diǎn)擬微綠球藻蛋白，產(chǎn)物ACE抑制活性從高到低。SHEIH等[22]酶解制備小球藻蛋白源ACE IPs時(shí)，胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物ACE抑制率高于風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶。

2.2 復(fù)合酶水解法

復(fù)合酶水解法制備ACE IPs常采用2種或多種酶酶解，可能會(huì)因酶切位點(diǎn)交叉而獲得新的高活性肽段，彌補(bǔ)單酶水解的不足，提高制備效率和肽段質(zhì)量。采用復(fù)合酶解法水解蛋白質(zhì)時(shí)，可同時(shí)加入不同蛋白酶進(jìn)行水解，但酶解條件不同的2種酶共同加入時(shí)可能會(huì)相互干擾，降低制備效率。雷桂潔等[30]將胰蛋白酶分別組合6種不同蛋白酶同時(shí)水解紫菜勻漿，水解效果均明顯弱于胰蛋白酶單獨(dú)水解的效果。另外，也可進(jìn)行順序水解，此時(shí)酶的加入順序也會(huì)影響蛋白水解度和產(chǎn)物ACE抑制率，且蛋白被水解程度與水解產(chǎn)物ACE抑制活性的強(qiáng)弱并不成正相關(guān)。眼點(diǎn)擬微綠球藻蛋白副產(chǎn)物經(jīng)堿性蛋白酶和胰蛋白酶依次水解后水解度為(64.3±19)%，ACE抑制率為(35.6±3.0)%，而調(diào)換兩酶順序后水解度降低至(48.3±0.5)%，但ACE抑制率卻提高至(38.1±1.8)%[31]。這可能是由于堿性蛋白酶是絲氨酸內(nèi)切酶，肽段經(jīng)胰蛋白酶作用后，堿性蛋白酶可作用的特異性位點(diǎn)減少了，也可能是堿性蛋白酶將胰蛋白酶酶解產(chǎn)生的有活性的肽段進(jìn)一步酶解后導(dǎo)致其活性喪失。

3 評(píng)價(jià)模型

多肽的實(shí)際降血壓效果對(duì)其是否能作為天然降血壓肽應(yīng)用于醫(yī)藥及保健品行業(yè)十分關(guān)鍵，因此，有必要對(duì)其降血壓效果進(jìn)行評(píng)估測(cè)定。目前常用評(píng)價(jià)方法包括體外化學(xué)法、細(xì)胞生物法和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法。

3.1 體外化學(xué)法

3.1.1 評(píng)價(jià)原理

ACE IPs的體外活性測(cè)定是基于分子水平的評(píng)價(jià)方式。與Ang Ⅰ結(jié)構(gòu)相似的模擬物能與ACE反應(yīng)，并生成具有特征吸收峰的馬尿酸(hippuric acid，Hip)或N-(3-[2-呋喃]丙烯)-苯丙氨酸(N-3(2-furyl) acryloyl)-(phenylalanine,FAP)。反應(yīng)式如下：

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu，HHL)+ ACE→組氨酰-亮氨酸+Hip；

馬尿酰-雙甘肽(Hippuryl-glycine-glycosyl，HGG)+ ACE→甘氨酰-甘氨酸+Hip；

N-(3-[2-呋喃]丙烯)-苯丙氨肽(FAPGG)+ ACE→甘氨酰-甘氨酸+FAP。

基于以上原理，根據(jù)Hip或FAP含量變化即可判斷ACE抑制活性的強(qiáng)弱。在酶解蛋白的步驟中，一般以水解度為響應(yīng)值，以ACE抑制率為指標(biāo)來(lái)考察酶對(duì)蛋白的水解效果。但抑制率會(huì)受抑制劑濃度的影響而發(fā)生變化，因此，在水解產(chǎn)物的分離純化過(guò)程中應(yīng)采用半數(shù)抑制濃度(IC50)來(lái)準(zhǔn)確分析ACE抑制活性。IC50越低表示肽的ACE抑制活性越強(qiáng)。

3.1.2 測(cè)定方法

一般采用體外化學(xué)法來(lái)初步判斷多肽的ACE抑制活性。ACE抑制活性的測(cè)定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等，其他方法如薄層色譜法、熒光分光光度法等較為少見(jiàn)。紫外分光光度法由CUSHMAN和CHEUNG等[32]創(chuàng)立，經(jīng)研究?jī)?yōu)化后沿用至今。CAO等[29]用分光光度法測(cè)定FAP在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，得出龍須菜蛋白源ACE IPs的ACE抑制率IC50為0.255 g/L-1。但分光光度法操作步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且Hip中易混有HHL，容易產(chǎn)生較大誤差。為降低試驗(yàn)操作要求、提高檢測(cè)效率，有學(xué)者建立了高效液相色譜法，此方法中降低的Hip或FAP的峰面積百分比可反映ACE抑制率。LIN等[33]采用高效液相色譜法不僅能很好分地離HHL和馬尿酸，還準(zhǔn)確得出胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶等酶水解小葉蕨藻蛋白的產(chǎn)物ACE抑制率IC50分別為0.20、29.74和31.71 g/L。長(zhǎng)期實(shí)踐證明高效液相色譜法靈敏度高、檢測(cè)效率高，能定量測(cè)定ACE抑制率IC50，但檢測(cè)過(guò)程中需要重復(fù)大量ACE抑制反應(yīng)，且難以實(shí)現(xiàn)高通量和快速篩選大量水解產(chǎn)物的ACE抑制活性。毛細(xì)管電泳法能彌補(bǔ)這種不足，且能在較短時(shí)間內(nèi)分析和收集系統(tǒng)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)ACE抑制活性測(cè)定和樣品篩選的全自動(dòng)化。HE等[34]使用4種不同蛋白酶水解12種海洋蛋白材料，采用毛細(xì)管電泳法快速測(cè)得了48種水解產(chǎn)物的ACE抑制率IC50。

3.2 細(xì)胞生物法

以往研究中通過(guò)構(gòu)建人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)或人胚胎肺成纖維細(xì)胞系(MRC-5)模型，檢驗(yàn)ACE IPs的細(xì)胞毒性，評(píng)估其是否具有用于未來(lái)治療高血壓的潛力。一般采用MTT法通過(guò)評(píng)估線粒體性能預(yù)測(cè)代謝能力，檢測(cè)相對(duì)細(xì)胞活力，考察ACE抑制肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響。QIAN等[27]分別用濃度為18.75～150 μmol/L的肽段Leu-Val-Thr-Val-Met處理MRC-5細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活力在94.7%～102.4%，存活率高。此外，考慮到NO是血壓的調(diào)節(jié)劑，其濃度升高可導(dǎo)致血管周圍的平滑肌細(xì)胞松弛而降低血壓，且細(xì)胞內(nèi)NO分泌異常時(shí)容易引起動(dòng)脈粥樣硬化的形成，試驗(yàn)中還會(huì)采用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的水平，研究ACE IPs對(duì)細(xì)胞系中NO產(chǎn)生量的影響。若肽段的存在會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)NO生成量下降或細(xì)胞活力下降，則表明該肽段存在細(xì)胞毒性。SAMARAKOON等[25]從眼點(diǎn)擬微綠球藻中獲得的ACE IPs可顯著提高HUVECs的NO生產(chǎn)水平，且經(jīng)不同濃度肽段處理后的細(xì)胞存活率都很高。

3.3 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法

在體外環(huán)境中被證明具有ACE抑制活性的肽并不一定能在體內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮實(shí)際降血壓作用。經(jīng)口服攝入后，多肽的生物利用率是影響其體內(nèi)活性的重要因素，為了使ACE IPs在體內(nèi)發(fā)揮降血壓作用，它們應(yīng)完整到達(dá)作用部位，因此采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法驗(yàn)證其在機(jī)體內(nèi)的降血壓活性是十分必要的。一般體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法可分為動(dòng)物試驗(yàn)法和臨床試驗(yàn)法。

3.3.1 動(dòng)物試驗(yàn)法

天然海藻來(lái)源ACE IPs具有良好的臨床應(yīng)用前景，能否在機(jī)體內(nèi)部發(fā)揮實(shí)際降血壓功能成為其應(yīng)用的限制條件，需經(jīng)過(guò)動(dòng)物和臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。動(dòng)物試驗(yàn)選擇自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)模型，進(jìn)行短期或長(zhǎng)期給藥試驗(yàn)。給藥方式包括口服給藥和皮下注射兩種，不同給藥方式實(shí)驗(yàn)組都需要以卡托普利、伊那普利等降壓藥物為陽(yáng)性對(duì)照組，并設(shè)置無(wú)劑量對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組等實(shí)驗(yàn)組。為檢驗(yàn)肽對(duì)血壓正常的大鼠是否產(chǎn)生不良影響，還應(yīng)同時(shí)對(duì)同源正常血壓的京都Wister大鼠(wistar kyoto rats，WKY)進(jìn)行給藥試驗(yàn)，試驗(yàn)包括口服空白組和口服肽組，或皮下注射空白組和皮下注射肽組。通過(guò)比較給藥前后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血壓(收縮壓)變化情況來(lái)評(píng)價(jià)肽的降血壓功能。在王茵等[35]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，SHR和WKY口服卡托普利后血壓均顯著下降，而紫菜降血壓肽僅對(duì)SHR有降壓作用。KO等[18]從橢圓小球藻中制備得到的ACE IPs能明顯降低SHR收縮壓，且降壓活性維持6 h后收縮壓回升至正常水平。利用裙帶菜蛋白源的小肽Tyr-His、Lys-Tyr、Phe-Tyr和Ile-Tyr對(duì)SHR喂食(10 mg/(d·kg體重)) 1周后,收縮壓在第1周分別顯著降低了34、26、34和25mmHg，降壓效果均可持續(xù)3～8周[36]。

3.3.2 臨床試驗(yàn)法

只有人類臨床試驗(yàn)結(jié)果才可作為宣稱肽具有實(shí)際安全性的證據(jù)，基于這一點(diǎn)，ACE IPs在投入降壓藥物的生產(chǎn)應(yīng)用前必須通過(guò)臨床研究來(lái)探索其療效程度和劑量范圍，并確認(rèn)不良反應(yīng)。探索性試驗(yàn)和確證性試驗(yàn)過(guò)程中需考慮對(duì)肽進(jìn)行有效性和安全性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括血壓變化、對(duì)靶器官的保護(hù)或損傷作用、對(duì)心血管并發(fā)癥的影響等。另外，合理選擇試驗(yàn)人群、設(shè)計(jì)試驗(yàn)和研究周期、分析聯(lián)合用藥情況等都是臨床試驗(yàn)中需要特別注意的問(wèn)題。但鑒于臨床試驗(yàn)開(kāi)展難度大，且關(guān)于海藻來(lái)源ACE IPs的活性研究還未成熟，海藻降血壓肽的相關(guān)研究還未進(jìn)入臨床階段。目前已有牦牛乳酪蛋白降血壓肽[37]、大豆低聚肽[38]、醋豆降壓肽[39]等食源性降血壓肽的臨床研究情況已被公布，且目前沒(méi)有出現(xiàn)負(fù)面報(bào)道。

4 展望

海洋藻類富含優(yōu)質(zhì)蛋白，其資源未被充分開(kāi)發(fā)和利用，因此有待對(duì)海藻資源進(jìn)行高效利用，并探索海藻蛋白源ACE IPs對(duì)ACE活性的抑制原理及其體內(nèi)消化吸收機(jī)制。部分研究者運(yùn)用分子對(duì)接模擬方式來(lái)確定食源性ACE IPs在ACE酶的活性位點(diǎn)內(nèi)的結(jié)合方式，預(yù)測(cè)肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)并評(píng)估ACE IPs活性[40-42]。但分子對(duì)接等研究是基于配體連接酶活性位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合機(jī)制，非競(jìng)爭(zhēng)性ACE IPs并不適合該模型，其抑制機(jī)制與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系尚不清楚。在ACE IPs制備中，酶工程得到了廣泛應(yīng)用，但由于海洋藻類蛋白的特殊性，導(dǎo)致陸生酶制劑無(wú)法高效水解海洋藻類蛋白質(zhì)，因此需要開(kāi)發(fā)和篩選適用于酶解海洋藻類蛋白的高效蛋白酶原。另外，由于ACE IPs存在分離純化工藝繁瑣、產(chǎn)量低等問(wèn)題，因此ACE IPs的生產(chǎn)難以形成產(chǎn)業(yè)鏈。為解決這一難題，已有學(xué)者利用BIOPEP、Pepsite2和PeptideRanker等數(shù)據(jù)庫(kù)，將計(jì)算機(jī)模擬分析應(yīng)用于模擬復(fù)合酶水解蛋白[25,34]、電子篩選ACE抑制肽和電子模擬肽的消化環(huán)境穩(wěn)定性[35,37]等方面。雖然相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)也需要進(jìn)一步探索和完善，但計(jì)算機(jī)模擬方式在ACE IPs的研究中應(yīng)用前景可觀，可能推動(dòng)實(shí)現(xiàn)ACE IPs的大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)程。