香葉木素通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化治療早期骨關(guān)節(jié)炎的可行性研究

丁洪志，穆 培，許志興，丁 歡，陸雄偉

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是當(dāng)今骨科最常見(jiàn)的慢性疾病之一，隨著預(yù)期壽命的增加，骨關(guān)節(jié)炎的患病率和發(fā)病率均上升，最終導(dǎo)致患者的關(guān)節(jié)功能下降，生活質(zhì)量下降，并帶來(lái)醫(yī)療成本及社會(huì)成本的浪費(fèi)。該病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前相關(guān)研究顯示，其病理改變涉及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜組織以及關(guān)節(jié)周?chē)‰祉g帶等，其中以關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨最受關(guān)注[1-2]。影響OA發(fā)展的危險(xiǎn)因素包括衰老、環(huán)境因素、關(guān)節(jié)發(fā)育不良和損傷、先天遺傳改變等[3]。

OA治療指南包括非藥物治療、藥物治療和手術(shù)方法[4]。對(duì)于早期OA，推薦的治療方法是非藥物治療，如減肥、有氧運(yùn)動(dòng)、物理治療等[5]。OA藥物包括非甾體抗炎藥(NSAIDs)、曲馬多、對(duì)乙酰氨基酚和阿片類(lèi)藥物，可以緩解癥狀，但由于其預(yù)防疾病進(jìn)展能力的報(bào)道有限，因此可能無(wú)法減少手術(shù)需求[6]。此外，目前還沒(méi)有批準(zhǔn)用于治療OA的有效藥物。

近10年研究顯示，軟骨下骨在OA中起著重要作用[7-11]。因此，破骨細(xì)胞作為骨吸收的主要細(xì)胞，最近成為治療溶骨性疾病的新靶點(diǎn)[9,11-12]。

香葉木素(Diosmetin)是天然黃酮類(lèi)化合物的一種，存在于菊花、留蘭香、蜘蛛香等天然藥物和檸檬、柑橘、花生等果實(shí)中，具有多重生物活性，如抗炎抑菌、抗氧化、抗腫瘤等，可以用來(lái)治療肝、肺、腎、眼、神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近期相關(guān)報(bào)道已經(jīng)證實(shí)其具有抑制破骨細(xì)胞分化功能[12]，然而，其在骨關(guān)節(jié)炎治療方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者首先在人體及小鼠體內(nèi)驗(yàn)證骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨改變與破骨細(xì)胞的相關(guān)性，然后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證香葉木素對(duì)于破骨細(xì)胞生成的抑制作用，進(jìn)而提出合理推測(cè)，即香葉木素可以通過(guò)抑制軟骨下骨中的破骨細(xì)胞活化，治療早期骨關(guān)節(jié)炎，延緩骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 香葉木素(美國(guó)Selleck Chemicals中國(guó)分公司，純度≥98%)；α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Laboratories公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MSCF)與受體激活核因子(NF)κB配體(RANKL)均購(gòu)自美國(guó)R & D Systems公司；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa中國(guó)分公司；所有引物均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器 Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；1300 SERIES A2型超凈臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)；STERI-CYCLE型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；7500 Real Time PCR System(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 通過(guò)骨髓沖洗從4周齡雄性C57BL/6小鼠中提取骨髓來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞(BMM)，并在添加有10%FBS、1%青霉素/鏈霉素和30 ng/ml M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基(稱(chēng)為完全α-MEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)5～7 d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至90%左右時(shí)用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，重懸后計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 重懸液計(jì)數(shù)后以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，待24 h后細(xì)胞貼壁，更換含有不同濃度的香葉木素的完全α-MEM培養(yǎng)液，分別于1、3、5 d后吸去舊培養(yǎng)基，加入含有10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 人體及動(dòng)物組織獲取 從上海市第九人民醫(yī)院(北部)骨科收集骨關(guān)節(jié)炎晚期行全膝關(guān)節(jié)置換患者的脛骨平臺(tái)標(biāo)本，共分析人體標(biāo)本6個(gè)；從上海市第九人民醫(yī)院動(dòng)物房購(gòu)買(mǎi)8周齡C57BL/6雄性小鼠共20只，分為ACLT(前交叉韌帶切除)手術(shù)組(12只)與假手術(shù)組(8只)，術(shù)后1、2個(gè)月安樂(lè)死后取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。組織標(biāo)本多聚甲醛固定48 h后流水過(guò)夜，更換酒精保存，外送技術(shù)公司行組織病理切片及染色。顯微鏡下拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.6 細(xì)胞TRAP染色檢測(cè)分化情況 重懸液計(jì)數(shù)后以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，待24 h后細(xì)胞貼壁，吸去舊培養(yǎng)基，更換為含有100 ng/ml的RANKL及不同濃度的香葉木素的完全α-MEM培養(yǎng)液，隔日換液1次，培養(yǎng)至7～9 d，待BMMs融合后，PBS清洗2～3次，4%多聚甲醛固定20～30 min后使用TRAP染色試劑盒染色。顯微鏡下拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.7 RT-PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因表達(dá)情況 重懸液計(jì)數(shù)后以30×104個(gè)/孔接種于6孔板中，待24 h后細(xì)胞貼壁，吸去舊培養(yǎng)基，更換為含有100 ng/ml的RANKL及不同濃度的香葉木素的完全α-MEM培養(yǎng)液，隔日換液1次，培養(yǎng)至破骨細(xì)胞生成后2 d。Trizol法提取RNA，離心收集各組BMMs細(xì)胞，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。根據(jù)NCBI上提交TRAP、CTSK的cDNA序列設(shè)計(jì)引物。TRAP：上游引物F：5′-CCTCTTCCCAACTCGTGCAG-3′，下游引物R：5′-TGAATCCATCTTGGCGGTGG-3′；CTSK：上游引物F：5′-GCGGGATCGTTATGCCTACA-3′，下游引物R：5′-GACGGCTCTTTCTGCTGCTA-3′；GAPDH：上游引物F：5′-GGAGAGTGTTTCCTCGTCCC-3′，下游引物R：5′-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3′，進(jìn)行qRT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參。PCR的反應(yīng)體系：SYBR 5 μl，上游引物F 0.2 μl，下游引物R 0.2 μl，ROXⅡ0.2 μl，cDNA 1.1 μl，ddH2O 3.3 μl；PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，延伸60 ℃ 40 s (TRAP、CTSK、GAPDH)，40個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)讀取光密度(D)值。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法(2-△△Ct)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。△△Ct=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct平均值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct平均值)-(對(duì)照組目的基因Ct平均值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct平均值)。

2 結(jié)果

2.1 骨關(guān)節(jié)炎患者患側(cè)與健側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨的破骨細(xì)胞數(shù)量存在差異 骨關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)組織染色(HE染色，翻紅O-固綠染色)結(jié)果顯示，兩側(cè)軟骨的病變程度明顯不同(圖1、圖2)。同時(shí)，兩側(cè)的軟骨下骨的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯不同，如圖1、圖2所示，TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，患側(cè)軟骨下骨的破骨細(xì)胞數(shù)量少于健側(cè)(P<0.05)。

2.2 小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中手術(shù)組軟骨下骨中的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn) 分別對(duì)ACLT術(shù)后1、2個(gè)月的小鼠膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行TRAP染色，如圖3所示。術(shù)后小鼠膝關(guān)節(jié)TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖3所示，術(shù)后1個(gè)月手術(shù)組軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)，這一差異在2個(gè)月后消失。另外，我們對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了micro CT掃描，分析了骨顯微結(jié)構(gòu)相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖4、圖5所示，術(shù)后小鼠膝關(guān)節(jié)明顯呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，相對(duì)骨體積(%)、骨小梁數(shù)量(/mm)、骨密度(g/cc)、連接密度(1/mm3)明顯減少(P<0.05)，骨小梁連接數(shù)(1/mm)明顯增加(P<0.05)。

2.3 香葉木素的細(xì)胞毒性檢測(cè) 通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)香葉木素的細(xì)胞毒性，如圖6所示。加入不同濃度香葉木素后，第1、3、5天分別檢測(cè)OD值以反映細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20、40 μmol/L香葉木素組顯示出明顯的細(xì)胞毒性，其OD值在加入香葉木素后第1、3、5天明顯降低(P<0.05)，而在第5天時(shí)，1.25 μmol/L香葉木素組細(xì)胞活性高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 人膝關(guān)節(jié)組織HE、TRAP、翻紅O-固綠染色結(jié)果

圖2 人膝關(guān)節(jié)組織OARSI評(píng)分、破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 手術(shù)組與假手術(shù)組術(shù)后1、2個(gè)月膝關(guān)節(jié)組織TRAP染色結(jié)果及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.4 香葉木素對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響 如圖7、圖8所示，與正常對(duì)照組相比，濃度為5 μmol/L及以上的香葉木素處理組TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，與對(duì)照組比較，加入2.5 μmol/L及以上的香葉木素后，破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因TRAP、CTSK表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖9。

圖4 小鼠術(shù)后1個(gè)月膝關(guān)節(jié)顯微CT掃描結(jié)果

圖5 小鼠術(shù)后2個(gè)月膝關(guān)節(jié)顯微CT掃描結(jié)果

圖6 香葉木素刺激1、3、5 d后不同藥物濃度組OD值檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前，OA的藥物治療可以減輕癥狀，但無(wú)法減少手術(shù)的需要[6]。大部分關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)軟骨下骨逐漸退化，在OA的發(fā)展過(guò)程中可能存在一些潛在的相互作用[13-14]。因此，通過(guò)抑制破骨細(xì)胞生成，有望減少軟骨下骨的丟失，減少關(guān)節(jié)軟骨的病變，發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。香葉木素是天然黃酮類(lèi)化合物的一種，在自然界中分布廣泛，目前相關(guān)研究證實(shí)其具有抗炎抑菌、抗氧化、抗癌作用[15]。香葉木素是香葉木素苷即地奧思明(Diosmin)在人體內(nèi)腸道菌群降解作用下去除糖苷鍵后的代謝產(chǎn)物之一，可被人體吸收并降解[16]。地奧思明作為黃酮類(lèi)靜脈活性藥物，通過(guò)增加靜脈張力，促進(jìn)淋巴液回流，促進(jìn)微循環(huán)，對(duì)痔瘡以及靜脈功能不全發(fā)揮治療作用[17]。

研究表明，軟骨下骨的變化也在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[18-19]。通常認(rèn)為軟骨下骨硬化與OA中的軟骨退化密切相關(guān)[20-21]。然而，除了這種肥大性O(shè)A之外，還提出了另一種OA表型，即骨質(zhì)疏松性O(shè)A，其特征在于軟骨下骨密度顯著降低和重塑增加[22-23]。據(jù)報(bào)道，軟骨下骨重建和骨形態(tài)變化水平顯著升高與骨質(zhì)疏松癥患者[24]和動(dòng)物模型中卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松癥更嚴(yán)重的軟骨退變有關(guān)[25-26]。軟骨下骨的改變主要由破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的平衡決定，破骨細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多或者活化會(huì)導(dǎo)致軟骨下骨的骨丟失，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn)。

圖7 不同藥物濃度組經(jīng)MCSF 30 ng/ml+RANKL 100 ng/ml誘導(dǎo)7 d后破骨細(xì)胞TRAP染色結(jié)果

圖8 不同藥物濃度組經(jīng)MCSF 30 ng/ml+RANKL 100 ng/ml誘導(dǎo)7 d后破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖9 不同藥物濃度組經(jīng)MCSF 30 ng/ml+RANKL 100 ng/ml誘導(dǎo)9 d后TRAP、CTSK基因表達(dá)水平結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

首先，OA患者人體標(biāo)本以及小鼠OA模型標(biāo)本的組織染色中，顯微CT掃描結(jié)果表明了破骨細(xì)胞與軟骨下骨病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性。在小鼠OA早期(術(shù)后1個(gè)月)的軟骨下骨結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn)(見(jiàn)圖2)，盡管在術(shù)后2個(gè)月的小鼠軟骨下骨CT分析中仍呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，但是破骨細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)較假手術(shù)組沒(méi)有明顯差異。人體標(biāo)本中證實(shí)，在OA晚期，軟骨病變嚴(yán)重側(cè)的軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量明顯少于健側(cè)(圖1A、圖1B)；因此，我們推測(cè)OA早期的軟骨下骨丟失與破骨細(xì)胞數(shù)量增多相關(guān)，而晚期的軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量降低，并最終導(dǎo)致軟骨下骨向早期骨關(guān)節(jié)炎相反的方向發(fā)展。因人體膝關(guān)節(jié)生理結(jié)構(gòu)原因，膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)受力較外側(cè)大，因此本研究中人體標(biāo)本數(shù)據(jù)顯示內(nèi)側(cè)為患側(cè)，外側(cè)為健側(cè)。

軟骨下骨是保證軟骨完整的必要條件，任何單純?yōu)榱酥委熫浌菗p傷而忽視軟骨下骨完整性的治療大多以失敗告終[27]。因此，針對(duì)軟骨下骨破骨細(xì)胞治療OA的新途徑逐漸得到關(guān)注。在細(xì)胞水平，香葉木素在未產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度對(duì)破骨細(xì)胞生成具有抑制作用，基因水平檢測(cè)也證實(shí)了其可以抑制破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因(如TRAP、CTSK)的表達(dá)。香葉木素的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高濃度香葉木素對(duì)BMMs具有一定細(xì)胞毒性(圖3A)，但是在尚未顯示出細(xì)胞毒性的濃度，香葉木素就已經(jīng)對(duì)破骨細(xì)胞生成產(chǎn)生抑制作用(圖3A、圖3D)。近期研究證實(shí)，香葉木素可以通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路活化，抑制破骨細(xì)胞生成[12]。

總之，本研究表明，破骨細(xì)胞的活化與OA早期軟骨下骨改變相關(guān)，香葉木素能夠抑制破骨細(xì)胞的生成，因此，香葉木素具有減少軟骨下骨丟失的潛能，并有望通過(guò)抑制軟骨下骨改變，治療早期OA，延緩OA進(jìn)程。