UV-VIS法測(cè)定濕熱消顆粒中總黃酮含量的不確定度評(píng)價(jià)

梁國(guó)成，陳舒茵，黃小鷗，馮文勇，方建康，覃 翔

0 引言

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis，CP)是男科常見(jiàn)病及多發(fā)病，發(fā)病率高，臨床以排尿異常、慢性盆腔疼痛為特征[1-4]。CP的臨床發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜且尚未明確，因此，在CP的臨床治療中，難以準(zhǔn)確對(duì)患者的病情做出根本改善。西醫(yī)主要根據(jù)患者的臨床病癥進(jìn)行針對(duì)性抗感染消炎治療[5-7]，然而患者在臨床對(duì)癥緩解治療的效果欠佳，并且常因多種因素在短期治愈后較為容易復(fù)發(fā)[8-9]。中藥復(fù)方制劑對(duì)前列腺炎的療效較好[10-13]，因此，研究開(kāi)發(fā)有效的藥物防治CP，尤其是療效肯定、不良反應(yīng)少、質(zhì)量可控的中藥、中成藥尤為必要。

濕熱消顆粒是由濕熱消湯改劑型研制而成，濕熱消湯是我院男性科名老中醫(yī)長(zhǎng)期用于防治CP的有效經(jīng)驗(yàn)方，由金錢草、虎杖、板藍(lán)根、黃芪等12味中藥組成，前期的臨床研究表明，濕熱消方對(duì)防治CP具有良好的治療效果[10-11]，而總黃酮為防治CP的有效成分之一[14-15]。

本試驗(yàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法(UV-VIS)測(cè)定制劑中總黃酮的含量，UV-VIS法因其操作簡(jiǎn)單、適用性廣等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于諸如總物質(zhì)含量測(cè)定等藥品分析領(lǐng)域。而試驗(yàn)樣品在制備、測(cè)量過(guò)程中，常常會(huì)因?yàn)槿藶椴僮髁?xí)慣、測(cè)量誤差、結(jié)果讀數(shù)誤差或者測(cè)量用具自身誤差等原因而不可避免地在測(cè)定過(guò)程和結(jié)果中引入一定誤差，因此，試驗(yàn)所得的測(cè)量值只能得到真實(shí)值的近似值，存在一定的誤差。不確定度的概念是合理的表征賦予被測(cè)量值的分散性與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[16-17]，是目前研究者較為認(rèn)可的一種科學(xué)、合理的質(zhì)量控制方法和驗(yàn)證手段[18]，能夠較為準(zhǔn)確地評(píng)估測(cè)量結(jié)果。

本文建立了UV-VIS法測(cè)定濕熱消顆粒中總黃酮含量的方法，并根據(jù)歐洲化學(xué)委員會(huì)頒布的Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement要求[19]，對(duì)測(cè)定方法和結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，探討該法試驗(yàn)過(guò)程中可能的不確定因素，提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，53WBI微機(jī)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，玻璃器皿為天玻牌A級(jí)。

1.2 試劑與試藥 濕熱消顆粒(自制，批號(hào)：1800508、1800511、1800517)，槲皮素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-201610，含量測(cè)定用)，乙醇(上海沃凱生物技術(shù)有限公司，分析純)，無(wú)水乙醇(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司，分析純)，AlCl3(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，NaCH3COOH(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，純化水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品10.13 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品15 g，精密加入70%乙醇100 ml，超聲1 h[20]，過(guò)濾，定容于250 ml容量瓶中，精密移取續(xù)濾液10 ml至25 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻，即得。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 ml，置于10 ml容量瓶中，20 ℃水浴加熱，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反應(yīng)2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫[21]，以相應(yīng)試劑為空白，在200～500 nm范圍進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，槲皮素對(duì)照品溶液與供試品溶液于442 nm處有最大吸收，光譜圖基本一致，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為442 nm，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

2.3 線性及線性范圍的考察 精密量取槲皮素對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、7 ml分別置于10 ml容量瓶中，20 ℃水浴加熱，先加入1.2 ml的AlCl3(0.1 mol/L)，后加入1.8 ml的NaCH3COOH溶液(1 mol/L)，反應(yīng)2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為442 nm處測(cè)量吸光度值。

以吸光度A(Y)為縱坐標(biāo)，槲皮素含量(mg)(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品，在442 nm波長(zhǎng)下，連續(xù)測(cè)定5次，其吸光度的RSD為0.12%，表明精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品，在442 nm波長(zhǎng)下，分別于0、1、2、4、8、12 h測(cè)定，測(cè)定6次，其吸光度的RSD為0.23%，表明溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次的濕熱消顆粒5份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下平行制備供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果RSD為0.19%，表明樣品重現(xiàn)性良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品5份，分別精密加入槲皮素對(duì)照品，照“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 樣品含量測(cè)定 取不同3個(gè)批次的濕熱消顆粒，分別按“2.1.2”項(xiàng)下平行制備供試品溶液，并依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 槲皮素回收率試驗(yàn)結(jié)果(mg)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/mg)

3 不確定度的評(píng)定

3.1 不確定度的來(lái)源 試驗(yàn)過(guò)程中，不確定度主要來(lái)源于儀器和人工操作偏差。本試驗(yàn)過(guò)程中，不確定度的來(lái)源主要有：對(duì)照品溶液制備過(guò)程引入的不確定度、供試品溶液制備過(guò)程引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度、樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度以及回收率測(cè)定所引入的不確定度[22-25]。

3.2 量化不確定度分量

3.2.1 對(duì)照品溶液制備引入的不確定度 對(duì)照品制備過(guò)程中使用十萬(wàn)分之一天平精密稱取10.13 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶(A級(jí))中，再以5 ml單標(biāo)移液管(A級(jí))精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，70%乙醇定容至刻度。故對(duì)照品溶液制備引入的不確定度U1有：①對(duì)照品稱量的不確定度M1，電子天平經(jīng)檢定為1級(jí)，允許誤差±0.100 mg；②溶液配制的不確定度V1，溶液配制過(guò)程用到50 ml、10 ml、5 ml單標(biāo)移液管(A級(jí))，據(jù)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程JJG196-2006要求[26]，允許誤差分別為±0.050 ml、±0.020 ml、±0.025 ml。其分量評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.2.2 供試品溶液制備引入的不確定度 用十萬(wàn)分之一天平精密稱取本品30 g，置于100 ml容量瓶(A級(jí))中并精密加入70%乙醇100 ml，超聲1 h，過(guò)濾，定容于250 ml容量瓶中，精密移取續(xù)濾液10 ml至25 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻。供試品溶液制備引入的不確定度U2有：①供試品稱量的不確定度M2，電子天平經(jīng)檢定為1級(jí)，允許誤差±0.100 mg；②溶液配制的不確定度V2，溶液配制過(guò)程用到100 ml、25 ml、10 ml允許誤差分別為±0.010 ml、±0.030 ml、±0.020 ml。其分量評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 對(duì)照品溶液的不確定度評(píng)定

表4 供試品溶液的不確定度評(píng)定

V2=0.003 5 ml,U2=0.003 5 mg

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度 本試驗(yàn)配制了7個(gè)濃度含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液Ci：0.010 13、0.020 26、0.030 39、0.040 52、0.050 65、0.060 72、0.070 84 mg，平均濃度C0=0.039 05 mg，在442 nm處測(cè)得平均吸光度Ai分別為：0.152、0.288、0.392、0.507、0.624、0.737、0.862，每個(gè)平行測(cè)定2次，用最小二乘法擬合，得到直線方程A=11.507X+0.042 8。見(jiàn)表5。

表5 線性最小二乘法擬合

取1份供試品，平行測(cè)定2次，由此得平均含量C0=0.031 7 mg。

3.2.4 樣品重復(fù)測(cè)定的不確定度 取“2.4.1”同一份樣品重復(fù)測(cè)定，5次測(cè)定得到含量分別為0.034 2、0.031 8、0.040 8、0.031 4、0.042 5 mg，平均含量為0.036 1 mg。

3.3 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 各相對(duì)不確定度分量值及貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6。

3.4 擴(kuò)展不確定度和報(bào)告不確定度 95%CI下，包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度U95=k×U×100%=2×0.116 9×100%=23.38%。由試驗(yàn)測(cè)定濕熱消顆粒中總黃酮含量W=0.031 9 mg/mg，故擴(kuò)展不確定度為：U95(W)=0.031 9×0.233 8=0.007 5 mg/mg。故本次試驗(yàn)測(cè)定得到濕熱消顆粒中總黃酮含量為：W=(0.031 9±0.007 5)mg/mg。

表6 UV-VIS測(cè)定濕熱消顆粒中總黃酮不確定度分量評(píng)定表

4 討論

總黃酮的含量測(cè)定方法有UV-VIS、HPLC、CE等[27-29]，其中以UV-VIS操作較為簡(jiǎn)單快速。黃酮及類黃酮化合物在200～800 nm光譜范圍的掃描表明，部分黃酮類化合物吸收較弱或無(wú)最大吸收[30]，所以，采用UV-VIS法測(cè)定總黃酮含量常常顯色后進(jìn)行測(cè)定，其中應(yīng)用最多的為金屬離子絡(luò)合法[31]。該法是黃酮類化合物在酸性或堿性條件下與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)后形成有色的鰲合物而產(chǎn)生較強(qiáng)的紫外吸收而測(cè)定含量，常用的顯色方法有AlCl3、AlCl3-CHCOONa、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH等。本試驗(yàn)采用AlCl3-CHCOONa法顯色，效果良好。

UV-VIS以分子吸收光譜為基礎(chǔ)，利用化合物分子在200～800 nm光譜范圍具有紫外吸收的特點(diǎn)進(jìn)行分析和測(cè)定，或經(jīng)顯色后產(chǎn)生紫外吸收而測(cè)定[31]，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用性廣、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)，已在中藥含量測(cè)定如總黃酮含量分析中廣泛應(yīng)用，且發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。在分析過(guò)程中，引入不確定度的概念，可最大程度地彌補(bǔ)因操作步驟繁多或操作不熟練、以及計(jì)量器具等因素而產(chǎn)生的誤差，同時(shí)操作人員在試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡可能減少操作步驟，提高操作熟練度，盡量避免使用小容量計(jì)量器具進(jìn)行量取、定容等，以減少因主觀和客觀因素而引入的不確定度，提高測(cè)量結(jié)果的可靠性。

試驗(yàn)過(guò)程中，定量方法的相對(duì)擴(kuò)展不確定度U95為23.38%，其中樣品重復(fù)測(cè)定不確定度U4為33.92%，對(duì)樣本含量測(cè)定結(jié)果影響較大。可能的原因有：①本次試驗(yàn)不確定度分量有由儀器測(cè)量的不確定度分量、樣品重復(fù)測(cè)定的不確定度分量和加標(biāo)準(zhǔn)品回收率引入的不確定度分量，包含了重復(fù)性的不確定度，且后兩者相關(guān)系數(shù)為-1，故應(yīng)減除重復(fù)性；②根據(jù)“重復(fù)性測(cè)量誤差與被測(cè)量的規(guī)格大小呈正比，而與被測(cè)量的級(jí)別高低呈反比”的普遍規(guī)律[32]，在進(jìn)行樣品的重復(fù)測(cè)定時(shí)，應(yīng)盡可能采用較低規(guī)格(即濃度)的樣品，或采用更高一級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)樣品(即純度)，校準(zhǔn)測(cè)量?jī)x器，并給出儀器的量傳誤差[33]，從而得到比較滿意的擴(kuò)展不確定度，最終降低樣品重復(fù)測(cè)定的不確定度U4。