二苯乙烯苷調(diào)控MAPKs信號(hào)通路誘導(dǎo)大腸癌SW116細(xì)胞凋亡

雷 銳，劉 艷

0 引言

大腸癌(Colorectal cancer)是常見的消化道惡性腫瘤，由美國癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的臨床調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球大腸癌的發(fā)病率及死亡率占惡性腫瘤的第5位，且每年新出現(xiàn)的患者例數(shù)在不斷增加[1-2]。目前大腸癌治療的手段以手術(shù)為主，化療是重要的輔助治療方案。然而臨床發(fā)現(xiàn)大多數(shù)化療藥物效果不佳，毒副作用較多，術(shù)后患者生存率較低[3-4]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)的3個(gè)成員，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等多個(gè)生物過程[5]。MAPKs是連接細(xì)胞膜表面受體和基因表達(dá)的重要信號(hào)調(diào)節(jié)酶，已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物腸道組織細(xì)胞內(nèi)至少存在4種MAPKs,即ERK、c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2)和p38 MAPK(α,β)和ERK5/BMK1，并且上述信號(hào)途徑還參與大腸腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲及遷移等生物學(xué)過程[6]。二苯乙烯苷(2,3,5,4′-etrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)主要來源于蓼科蓼族植物何首烏，屬于一種具有天然生物活性的抗毒素，其在抗氧化、抗炎癥方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[7-8]。此外，THSG在抗腫瘤方面也有較高的生物活性，包括通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[9]；通過調(diào)節(jié)MAPKs信號(hào)通路抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖[10]。本文以大腸癌SW116細(xì)胞為研究對(duì)象，探討了THSG對(duì)SW116細(xì)胞增殖、凋亡及MAPKs信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大腸癌SW116細(xì)胞購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；二苯乙烯苷購自上海寶曼生物科技有限公司，批號(hào)：6634-52-6；Western blot試劑購自武漢谷歌生物有限公司；CCK8試劑盒購自上海工程生物公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物有限公司，批號(hào)：KGA106；兔抗p38、ERK、JNK、p-p38、p-ERK、p-JNK、Pro-caspase 3、Cleaved-PARP和β-actin抗體購自英國Abcam公司；JNK特異性抑制劑(SP600125)、p38特異性抑制劑(SB203580)和ERK特異性抑制劑(U0126)購自美國Sigma公司。

1.2 SW116細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存于液氮中的SW116細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇，待細(xì)胞貼壁飽和至適當(dāng)密度后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，具體操作如下：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶至超凈工作臺(tái)，無菌PBS清洗2遍，加入適量濃度的胰蛋白酶消化至細(xì)胞變圓，然后加入新鮮培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞吹散后轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液吹散分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 把生長良好的細(xì)胞消化、重懸、接種于96孔板中，每孔加入200 μl細(xì)胞混懸液，邊緣孔用200 μl PBS填滿后培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度THSG (0、5、10、20、40、80、120 mmol/L)的培養(yǎng)液處理SW116細(xì)胞24、48、72 h后，取出96孔板，棄上清，每孔加入20 μl CCK8溶液，孵育2 h后采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度OD值，并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 把生長良好的細(xì)胞消化、重懸、接種于6孔板中，每孔加入2 ml細(xì)胞混懸液培養(yǎng)24 h，加入含不同濃度THSG (0、10、20、40 mmol/L)的培養(yǎng)液處理SW116細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，懸浮細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移至離心管，貼壁細(xì)胞胰酶消化后轉(zhuǎn)移至離心管，再用PBS清洗細(xì)胞3次，5 000 r/min離心6 min，收集細(xì)胞；將細(xì)胞重懸后分別加入5 μl Annexin V和 PI避光染色，利用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot分析蛋白表達(dá) 把對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞消化、重懸、接種于6孔板中，每孔加入2 ml細(xì)胞混懸液培養(yǎng)24 h，加入含不同濃度THSG (0、10、20、40 mmol/L)的培養(yǎng)液處理SW116細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，加入裂解液冰上充分裂解30 min，經(jīng)超聲破碎后離心取上清，100 ℃煮沸5 min使蛋白充分變性。蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離后將其轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。TBST洗膜2次后孵育一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗1.5 h；TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光液浸泡3 min后進(jìn)行曝光。

1.6 特異性抑制劑實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長至60%左右時(shí)，加入p38、JNK、ERK特異性抑制劑SB203580 (10 μmol/L)、SP600125 (5 μmol/L)和U0126 (8 μmol/L)單獨(dú)干預(yù)細(xì)胞1 h，然后THSG (20 mmol/L)處理24 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Western blot分析相關(guān)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 THSG抑制SW116細(xì)胞增殖 CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)THSG能明顯抑制SW116細(xì)胞增殖，見圖1。

圖1 THSG對(duì)SW116細(xì)胞增殖的影響

由圖1可見，THSG濃度在5～120 mmol/L范圍內(nèi)，能夠明顯抑制SW116細(xì)胞的增殖，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。對(duì)于同一劑量的THSG而言，隨著干預(yù)時(shí)間的延長，細(xì)胞的存活率降低，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。

2.2 THSG誘導(dǎo)SW116細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測SW116細(xì)胞凋亡情況，見圖2。不同劑量(0、10、20、40 mmol/L)THSG處理SW116細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為2.6%±1.2%、7.9%±1.8%、29.4%±5.1%、47.4%±5.6%，各藥物處理組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 THSG對(duì)SW116細(xì)胞凋亡的影響

2.3 THSG對(duì)SW116細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Pro-caspase 3和Cleaved-PARP表達(dá)的影響 Western blot檢測SW116細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Pro-caspase 3和Cleaved-PARP表達(dá)水平，見圖3。發(fā)現(xiàn)THSG對(duì)SW116細(xì)胞中Cleaved-PARP蛋白表達(dá)有誘導(dǎo)作用，而對(duì)Pro-caspase 3蛋白表達(dá)有抑制作用，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 THSG對(duì)SW116細(xì)胞中MAPKs信號(hào)通路的影響 THSG干預(yù)組與對(duì)照組比較，SW116細(xì)胞中p-ERK的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，而p-p38和p-JNK的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，變化程度表現(xiàn)出濃度依賴性。見圖4。

2.5 抑制劑改變THSG對(duì)MAPKs信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡 分別采用p38、JNK和ERK的特異性抑制劑SB203580、SP600125和U0126單獨(dú)干預(yù)SW116細(xì)胞1 h，之后THSG處理24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125可以減弱THSG對(duì)p38、JNK磷酸化的誘導(dǎo)作用，U0126則增強(qiáng)了THSG對(duì)ERK磷酸化的抑制作用，見圖5。采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)各組藥物干預(yù)細(xì)胞的凋亡率如下：對(duì)照組(3.4%±1.3%)、THSG組(30.7%±5.6%)、SB203580組(6.4%±1.8%)、SP600125組(4.6%±1.4%)、U0126組(37.6%±5.8%)、THSG+SB203580組(15.3%±4.2%)、THSG+SP600125組(18.7%±4.7%)、THSG+U0126組(46.9%±6.2%)，其中THSG組與THSG+抑制劑組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 THSG對(duì)SW116細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖4 THSG對(duì)SW116細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路的影響

圖5 特異性抑制劑對(duì)p38、JNK和ERK信號(hào)途徑活化的影響

3 討論

大腸癌在腫瘤致死亡數(shù)中所占比例較高，術(shù)后5年生存率為60%，若出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，患者5年生存率不到10%[11-12]。早期較多研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有多種藥理作用，如聯(lián)合化療藥物可增敏減毒、降低腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等，在大腸癌的治療中也表現(xiàn)出較高的生物活性[13]。其中二苯乙烯苷(THSG)的藥理活性主要表現(xiàn)在抗炎和抗氧化等方面，近年來亦有THSG抗腫瘤活性的研究[9-10]。

本文采用大腸癌SW116細(xì)胞為體外研究對(duì)象，考察了THSG對(duì)SW116細(xì)胞增殖凋亡的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，THSG在5～120 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)SW116細(xì)胞的增殖活性均有抑制作用，在THSG濃度低于50 mmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率低于50%，并且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的萎縮等生長不良現(xiàn)象，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10、20、40 mmol/L的THSG處理細(xì)胞。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THSG呈時(shí)間和濃度依賴的方式抑制SW116細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀分析SW116細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)，THSG處理SW116細(xì)胞后，大腸癌細(xì)胞的凋亡率均有不同程度的增加。PARP和caspase 3蛋白表達(dá)調(diào)控著細(xì)胞凋亡過程，在腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生過程PARP的切割顯著增強(qiáng)，而Pro-caspase 3的表達(dá)亦因切割而明顯降低[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，THSG能顯著誘導(dǎo)PARP切割，抑制Pro-caspase-3蛋白表達(dá)，促使SW116細(xì)胞凋亡發(fā)生。

ERK、JNK和p38 MAPK屬于MAPKs家族的3個(gè)成員，介導(dǎo)著腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移等多個(gè)生物過程[5-6]。有關(guān)報(bào)道證實(shí)JNK和p38 信號(hào)通路激活能夠?qū)е录?xì)胞凋亡[16]，然而ERK信號(hào)傳導(dǎo)活化可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖及分化，屬于細(xì)胞存活的正向調(diào)節(jié)子[17]。然而，已有研究提出，THSG能夠通過調(diào)節(jié)MAPKs信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10]。使用p38、JNK和ERK的特異性抑制劑SB203580、SP600125和U0126抑制MAPKs信號(hào)通路活化，也可以證實(shí)p38、JNK和ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與腫瘤細(xì)胞凋亡過程。本研究發(fā)現(xiàn)，THSG干預(yù)SW116細(xì)胞后，細(xì)胞中ERK的磷酸化水平顯著降低，而p38和JNK的磷酸化水平顯著升高，而且ERK、p38和JNK磷酸化水平變化與THSG的用藥劑量呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)MAPKs信號(hào)通路確實(shí)介導(dǎo)了THSG誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用p38、JNK和ERK特異性抑制劑阻斷MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)，流式細(xì)胞儀觀察SW116細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷p38、JNK磷酸化可以部分逆轉(zhuǎn)THSG誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡；ERK特異性抑制劑能增強(qiáng)THSG誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的凋亡?？傊?，THSG通過激活p38和JNK信號(hào)傳導(dǎo)，抑制ERK信號(hào)途徑，誘導(dǎo)大腸癌SW116細(xì)胞凋亡。