青蒿素基于PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

王 朦，賈國(guó)存*，成怡冰，王海軍，劉 煒，郭亞瓊

0 引言

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)為起源于多能干細(xì)胞的髓系增殖性腫瘤，在兒童中發(fā)病率高，預(yù)后差[1]。目前主要采用化療、干細(xì)胞移植與放療等手段進(jìn)行治療，化療藥物毒副作用大，干細(xì)胞移植要求高，兼容性差，排斥反應(yīng)大；放療可引起相鄰器官組織損傷。因此，尋找高效低毒、可行性高的藥物迫在眉睫[2]。隨著人們對(duì)AML研究的深入，信號(hào)通路逐漸成為其研究重點(diǎn)，其中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinases，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase，PKB，又稱AKT)受到了廣泛關(guān)注，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等生物學(xué)行為過(guò)程密切相關(guān)，可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[3]。青蒿素是我國(guó)中醫(yī)學(xué)家首次從菊科植物黃花蒿中提取的新型中成藥。青蒿琥酯(Artesunate，ART)是青蒿素類衍生物，有潛在抗腫瘤作用，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖與分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。本文主要基于PI3K/AKT信號(hào)通路分析青蒿素對(duì)人AML細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2016年10月至2018年10月我院收治的44例AML患兒，均經(jīng)世界衛(wèi)生組織(WHO)的MICM分型明確診斷，為初治或復(fù)發(fā)病例，且免疫表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗原陽(yáng)性細(xì)胞≥20%，患兒家屬均對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情且簽署知情同意書(shū)。其中，男27例，女17例；年齡9個(gè)月～14歲，平均(8.20±0.86)歲；2010年美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)危險(xiǎn)分級(jí)：低危、中危、高危分別16例、23例、5例。另選擇人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株4株，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心傳代保存。

1.2 主要儀器與試劑 儀器：5417低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppondoff公司)；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(日本，Olympus)；FACSCaliber流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

試劑：注射用青蒿琥酯粉針劑(廣西桂林南藥股份有限公司，60 mg/支)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(杭州，四季春)；Trizol試劑(美國(guó)Ambiong公司)；全蛋白提取試劑盒(凱基生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)；Goat anti-Rabbit二抗(Boster公司)或HRP標(biāo)記的Goat anti-Mouse二抗(Boster公司)；Western blot凝膠制備試劑盒(武漢谷歌生物公司)；β-action(中國(guó)，Abmart公司)；PI3K、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 方法

1.3.1 青蒿琥酯溶液的配制 無(wú)菌條件下，將60 mg青蒿琥酯粉針劑(1瓶)，加入5% NaHCO3溶液1 ml，振搖1 min使之充分溶解，注入RPMI-1640培養(yǎng)液適量，混勻，依次制成濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的青蒿琥酯溶液，保存于-20 ℃?zhèn)溆?，另選擇不含青蒿琥酯的RPMI-1640培養(yǎng)液100 ml作為對(duì)照。

1.3.2 人AML原代細(xì)胞的提取及K562細(xì)胞株的培養(yǎng) 將44例AML患兒隨機(jī)分為4組，各11例；K562細(xì)胞株隨機(jī)分為4組，每組1株。在無(wú)菌條件下取AML患兒骨髓液4～5 ml，加入抗凝離心管(含肝素0.3 ml)中，取等體積PBS液對(duì)骨髓液進(jìn)行稀釋，充分混勻。取淋巴細(xì)胞分離液4～5 ml加入干燥離心管，將稀釋后的骨髓液緩慢加入分離液上層，于2 500 r/min下離心約20 min，取中間呈白膜狀單個(gè)核細(xì)胞層，移入另一個(gè)干燥潔凈的離心管，采用PBS液漂洗2次，之后在1 000 r/min下離心5 min，棄上清液，以1640培養(yǎng)液稀釋，加入75 ml培養(yǎng)瓶，放置在37 ℃、濕度95%、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。K562細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，以PBS洗滌細(xì)胞2次，普通培養(yǎng)基重懸，取30 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞活度，以每孔3×105～5×105個(gè)細(xì)胞接種在24孔板，加入相應(yīng)濃度的青蒿琥酯，培養(yǎng)72 h。

1.3.3 細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)觀察 提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞層，加入適量含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，調(diào)細(xì)胞初始濃度為1×106個(gè)/ml。分別于提取時(shí)及培養(yǎng)24、48、72 h觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞，在低倍顯微鏡下(100×)觀察計(jì)數(shù)板細(xì)胞數(shù)，其中呈藍(lán)色染色細(xì)胞為死亡細(xì)胞，不染色細(xì)胞為活細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%，將計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液滴樣的所得數(shù)值求平均值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集，取1×106個(gè)細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 制備12%分離膠和4%積層膠，微量加樣器加入20 μg總蛋白，連接電泳槽與電源正負(fù)極，濃縮膠60 V電泳30 min，分離膠100 V電泳70 min，之后將濾紙和膜置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min，低溫穩(wěn)流搖動(dòng)，封閉60 min，按1∶3 000稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，10 min/次，以HRP標(biāo)記的Goat anti-Rabbit二抗(Boster公司)1∶6 000孵育相應(yīng)的膜，緩慢搖動(dòng)，室溫孵育120 min，漂洗，曝光10 s，以KODAK顯影液和定影液沖洗膠片，培清凝膠成像分析系統(tǒng)分析拍照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562 24 h內(nèi)細(xì)胞存活率≥80%，對(duì)照組AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562 48～72 h細(xì)胞存活率仍≥70%，而實(shí)驗(yàn)組AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562培養(yǎng)48 h細(xì)胞存活率均降至50%以下，且明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。在培養(yǎng)72 h后，隨著青蒿素濃度上升，原代細(xì)胞與K562細(xì)胞株的細(xì)胞存活率下降，實(shí)驗(yàn)組青蒿琥酯25 μg/ml、50 μg/ml組72 h后細(xì)胞大量死亡，存活率≤10%，實(shí)驗(yàn)組青蒿琥酯25.0 μg/ml組的細(xì)胞存活率最低，明顯低于12.5 μg/ml組及對(duì)照組(P<0.05)，25.0 μg/ml組、50.0 μg/ml組的細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 不同濃度青蒿琥酯對(duì)原代細(xì)胞存活率的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

圖2 不同濃度青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞存活率的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

2.2 不同濃度青蒿素對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 培養(yǎng)48 h后，原代細(xì)胞及K562細(xì)胞株中各組中PI3K、P-AKT、Bcl-2均明顯下調(diào)(P<0.05)，而B(niǎo)ax、caspase-3、PTEN表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖3、圖4。青蒿琥酯25 μg/ml組培養(yǎng)48 h后PI3K、P-AKT、Bcl-2低于對(duì)照組及青蒿琥酯12.5 μg/ml組，而B(niǎo)ax、caspase-3、PTEN最高(P<0.05)，除25 μg/ml組與50 μg/ml組外，其他各組上述指標(biāo)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組AKT無(wú)明顯變化，且組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 不同濃度青蒿素對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

表2 不同濃度青蒿素對(duì)K562細(xì)胞株凋亡相關(guān)蛋白的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

圖3 不同濃度青蒿琥酯對(duì)AML原代細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 不同濃度青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

急性白血病為兒童時(shí)期最常見(jiàn)的惡性腫瘤，可分為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)及AML。其中，AML為臨床及生物學(xué)特性均有異質(zhì)性的惡性疾病，其長(zhǎng)期治療仍面臨著復(fù)發(fā)率與治療相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)高及化療相關(guān)不良反應(yīng)多等挑戰(zhàn)[5]。隨著生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展，研究者針對(duì)白血病細(xì)胞增殖、分化和凋亡的不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究出不同的抗白血病藥物，其中PI3K/AKT信號(hào)通路在近年來(lái)受到關(guān)注[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路在人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮著重要作用，其活化有促進(jìn)K562增殖和抑制K562凋亡的作用，因此是治療AML的新靶點(diǎn)[8]。青蒿琥酯為中國(guó)自主研發(fā)的青蒿素類抗瘧特效藥，作為可溶性青蒿素類衍生物，青蒿琥酯能調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、抑制腫瘤血管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，但其對(duì)AML影響的研究較少。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)精細(xì)的過(guò)程，經(jīng)復(fù)雜的基因編碼分析網(wǎng)絡(luò)調(diào)控正常組織的生長(zhǎng)及體內(nèi)平衡參與凋亡，包括死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞外途徑與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)途徑[10]，其中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)途徑是研究重點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素呈濃度依賴性誘導(dǎo)人AML原代細(xì)胞及K562細(xì)胞株凋亡，在培養(yǎng)48 h后，隨著藥物濃度增加，原代細(xì)胞、K562細(xì)胞的存活率均下降，意味著更多的AML細(xì)胞凋亡，這與王瑋琴等[11]報(bào)道的不同濃度青蒿琥酯(0、1.87、3.75、7.5、15 μmol/L)青蒿琥酯處理12 h后，K562細(xì)胞與阿霉素耐藥K562細(xì)胞凋亡率依次增加的結(jié)果相近，說(shuō)明青蒿琥酯可呈濃度依賴性誘導(dǎo)AML原代細(xì)胞或細(xì)胞株K562凋亡，青蒿琥酯為青蒿中提取的倍半萜內(nèi)酯藥物，有顯著的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，且不產(chǎn)生耐藥性，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路有調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組青蒿琥酯濃度為25.0 μg/ml的細(xì)胞存活率最低，25.0 μg/ml組、50.0 μg/ml組的細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明25 μg/ml可能是青蒿琥酯作用于AML的最佳劑量。

PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，PI3K的激活能促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡，AKT為PI3K下游重要的靶激酶，均是PI3K/AKT信號(hào)通路的重要組成部分，與各種生理狀態(tài)下的線粒體凋亡有關(guān)[13]。線粒體通路的基本環(huán)節(jié)為外界凋亡刺激引起線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致內(nèi)膜中細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)中，形成凋亡小體，激活caspase-9、caspase-3，激活的caspase在細(xì)胞凋亡中起主要作用[14]，且研究也證實(shí)Bcl-2家族經(jīng)Bax等凋亡基因及Bcl-2等抗凋亡基因的調(diào)節(jié)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮核心作用[15]。Bcl-2既可阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，降低Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性，阻斷細(xì)胞凋亡，也可阻止caspase的活化而發(fā)揮其抗凋亡作用。Bcl-2參與抗氧化通路，可改變線粒體膜電位，調(diào)控細(xì)胞凋亡。而PTEN抗腫瘤作用主要通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶活性，調(diào)控信號(hào)分子AKT去磷酸化而實(shí)現(xiàn)。本研究顯示，培養(yǎng)48 h后，原代細(xì)胞及K562細(xì)胞株中各組PI3K、P-AKT、Bcl-2均明顯下調(diào)，而B(niǎo)ax、caspase-3、PTEN表達(dá)上調(diào)，表明青蒿琥酯可能通過(guò)抑制原代AML細(xì)胞及K562細(xì)胞株中PI3K/AKT通路，調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN)的表達(dá)，如活化caspase-3，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，上調(diào)PTEN抑癌基因表達(dá)而抑制AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡[16]。此外，本研究中，青蒿琥酯25 μg/ml組培養(yǎng)48 h后，PI3K、P-AKT、Bcl-2低于對(duì)照組及青蒿琥酯12.5 μg/ml組，而B(niǎo)ax、caspase-3、PTEN最高，除25 μg/ml與50 μg/ml組外，其他各組上述指標(biāo)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)青蒿琥酯濃度為25 μg/ml時(shí)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用最佳，此時(shí)青蒿琥酯藥物濃度也可能達(dá)最大。

綜上所述，青蒿素類衍生物青蒿琥酯可能通過(guò)抑制PIK/AKT信號(hào)通路而調(diào)控Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)人AML細(xì)胞及K562細(xì)胞凋亡。