ctDNA在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

在世界范圍內(nèi)，前列腺癌是男性第二大常見惡性腫瘤及導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的第五大原因[1]，在美國其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤首位[2]。雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy，ADT）是晚期前列腺癌的重要治療手段，但幾乎所有患者經(jīng)治療后都會(huì)進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）[3]，預(yù)后極差。雖然診治水平不斷進(jìn)步，但mCRPC仍不可治愈，迫切需有更新的方法用于診治及監(jiān)測等。

近年來在mCRPC中，對于循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）進(jìn)行了深入研究。ctDNA是從原發(fā)腫瘤、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性腫瘤中釋放到血液的單鏈或雙鏈DNA，含有與原始腫瘤細(xì)胞相同的基因組成和異質(zhì)性[4]，可作為獨(dú)特的遺傳標(biāo)記或生物標(biāo)志物，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的工具。本文將對ctDNA在mCRPC中的檢測及應(yīng)用于耐藥機(jī)制和病情監(jiān)測等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ctDNA概述

無論腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，其脫落到循環(huán)系統(tǒng)的DNA均稱為無細(xì)胞DNA（cell-free DNA，cfDNA），ctDNA則是從腫瘤細(xì)胞脫落到循環(huán)系統(tǒng)的cfDNA，長度一般不超過200個(gè)堿基對[5]，其確切的起源和釋放機(jī)制尚不完全清楚，目前主要認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死及腫瘤細(xì)胞的分泌釋放有關(guān)。根據(jù)腫瘤類型、腫瘤負(fù)荷或腫瘤分期的不同，在血液中發(fā)現(xiàn)ctDNA占cfDNA的比例為0.01%～90.00%，半衰期平均為2 h[6]。檢測血漿中ctDNA，可識別原發(fā)腫瘤中存在的點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異以及染色體和表觀遺傳學(xué)改變[7]。此外，基于ctDNA獲取便捷、樣本來源充足、可重復(fù)進(jìn)行檢測等特點(diǎn)，可作為惡性腫瘤研究中具有巨大應(yīng)用潛力的工具。

2 mCRPC中ctDNA檢測

2.1 ctDNA檢測情況和基因組變化

ctDNA是通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法，如BEAMing、ARMS-PCR、微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR），或二代測序（next generation sequencing，NGS）方法檢測到的，幾種常見檢測方法的特點(diǎn)見表1，2。

表1 基于PCR檢測ctDNA的方法比較

表2 基于NGS檢測ctDNA的方法比較

在mCRPC患者中，ctDNA含量及可檢測性高，在75%患者中ctDNA分?jǐn)?shù)（ctDNA在cfDNA中的比例）＞2%，約50%患者ctDNA分?jǐn)?shù)＞30%[8-9]，利用包括比較基因組雜交和單基因二代測序技術(shù)，可在75%以上的患者中檢測出ctDNA[10]。

Sonpavde等[11]研究發(fā)現(xiàn)，mCRPC患者的ctDNA改變主要包括非同義突變和擴(kuò)增，其中最常見的復(fù)發(fā)性體細(xì)胞突變基因包括TP53占36%、雄激素受體（androgen receptor，AR）占22%、腺瘤性息肉病桿菌（adenomatous polyposis coli，APC）占10%、神經(jīng)纖維蛋白1（neurofibromin 1，NF1）占9%，拷貝數(shù)增加最常見基因包括AR占30%、MYC占20%和BRAF占18%。Hahn等[12]進(jìn)一步檢測了患者在治療過程中ctDNA基因組的變化，發(fā)現(xiàn)ctDNA改變主要為核苷酸變異、拷貝數(shù)變異、插入/刪除、融合以及重新排列。該研究對未接受新治療的患者間隔1年進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示基因組結(jié)構(gòu)并未隨時(shí)間推移而出現(xiàn)顯著性差異，與此相反，接受過1次新治療的患者出現(xiàn)更多的基因組改變，說明患者的ctDNA基因組結(jié)構(gòu)隨著治療的改變發(fā)生變化。

2.2 ctDNA與轉(zhuǎn)移性腫瘤組織活檢的一致性

組織活檢可明確轉(zhuǎn)移病灶、獲取體細(xì)胞基因組特征，但通常是對單個(gè)轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行活檢，不能解決克隆異質(zhì)性的問題。骨骼是mCRPC最常見的轉(zhuǎn)移部位，但骨組織活檢困難，不能獲得足量的腫瘤DNA，臨床效益并不高。檢測ctDNA能充分了解腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性，其結(jié)果也不會(huì)與轉(zhuǎn)移病灶的組織活檢相混淆。因此，ctDNA有望取代組織活檢，但兩者檢測到的基因組改變保持一致是必要的前提。有研究表明[10，13]，mCRPC患者的cfDNA（可看作ctDNA粗略的替代品）突變或拷貝數(shù)變異與轉(zhuǎn)移病灶的體細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)具有一致性。Wyatt等[8]對前列腺癌患者的ctDNA研究發(fā)現(xiàn)，對ctDNA中的72個(gè)臨床相關(guān)基因進(jìn)行靶向測序，與轉(zhuǎn)移病灶組織的外顯子測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移病灶組織中出現(xiàn)的所有體細(xì)胞突變同時(shí)存在于ctDNA中，對于一些關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因突變，如AR、SPOP、TP53等，兩者的一致性超過90%，此外共享突變的變體等位基因?qū)哟谓Y(jié)構(gòu)在兩者之間也高度相似。在另一個(gè)類似的研究中[12]，ctDNA與轉(zhuǎn)移病灶組織的基因組改變一致率高達(dá)96%。因此，ctDNA檢測可識別轉(zhuǎn)移病灶組織中的基因組改變，取代組織活檢成為更好的工具。

3 在mCRPC中ctDNA的應(yīng)用

3.1 患者耐藥性機(jī)制中的ctDNA研究

阿比特龍和恩雜魯胺是mCRPC患者的首選藥物，但20%～40%患者在治療初期就表現(xiàn)出耐藥性，并且所有患者均不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥[14]。AR基因改變是患者產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，如AR擴(kuò)增和突變、AR共激活或共抑制修飾、AR剪接變異體等[15]，mCRPC患者ctDNA中的AR基因改變易于檢測[8，11]，因此可借助ctDNA研究mCRPC的耐藥性。

Romanel等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA中檢測到AR突變（包括L702H和T878A）或拷貝數(shù)增加的患者對阿比特龍療效較差，ctDNA中這些AR基因的改變可預(yù)測患者的耐藥性；與Azad等[17]的研究結(jié)論相一致，在對阿比特龍和恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥的患者中，ctDNA可檢測到AR基因的拷貝數(shù)增加和突變。Annala等[18]研究還發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生耐藥性患者的ctDNA外顯子3'攜帶截?cái)嗟腁R基因配體結(jié)構(gòu)域，證實(shí)ctDNA中AR基因的截?cái)嗯c原發(fā)性耐藥有關(guān)。但有研究表明[19]，ctDNA中的AR基因擴(kuò)增并不排除良好的療效，意味著AR擴(kuò)增與耐藥性的關(guān)系仍需進(jìn)一步證實(shí)。通過ctDNA研究mCRPC的耐藥機(jī)制具有可行性，目前主要集中于AR基因的研究。因mCRPC的相關(guān)基因非常廣泛，耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，仍需對在耐藥機(jī)制中ctDNA的應(yīng)用進(jìn)行深入研究，未來有望利用ctDNA發(fā)現(xiàn)新的靶向藥物，克服患者的耐藥性，改善預(yù)后。

3.2 ctDNA對患者疾病進(jìn)展及預(yù)后的監(jiān)測

mCRPC患者在疾病進(jìn)展及接受治療的過程中，ctDNA的定量及基因組特征均可發(fā)生改變。研究表明，高濃度的ctDNA和高ctDNA分?jǐn)?shù)與患者預(yù)后不良及總體腫瘤負(fù)荷指數(shù)相關(guān)[16]。治療后ctDNA的下降程度亦與預(yù)后有關(guān)，行AR導(dǎo)向治療患者的ctDNA分?jǐn)?shù)比基線或疾病進(jìn)展時(shí)更低，這部分患者表現(xiàn)出更好的預(yù)后，并且治療前ctDNA分?jǐn)?shù)較低的患者預(yù)后最好[18]。一項(xiàng)對轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者進(jìn)行奧拉帕尼治療的TOPARP-A研究表明，治療8周后cfDNA（作為ctDNA的替代品）下降50%以上的患者，無進(jìn)展生存期和總生存期明顯延長[20]。ctDNA中較高數(shù)量的基因改變也預(yù)示著患者較差的預(yù)后，尤其是AR基因[11]，但AR基因改變主要導(dǎo)致治療耐藥性的發(fā)生，這可能是造成較差預(yù)后的主要原因。ctDNA也可在前列腺癌轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)生變化，伴有骨轉(zhuǎn)移的患者[19]，以及在新發(fā)轉(zhuǎn)移性前列腺癌尤其是內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的患者中[21]，ctDNA分?jǐn)?shù)明顯升高。長期以來，mCRPC最主要的監(jiān)測指標(biāo)是前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA），但PSA存在一些局限，如腫瘤Gleason評分較高或患者進(jìn)入晚期階段時(shí)，PSA數(shù)值與腫瘤負(fù)荷相關(guān)性不高[22]，敏感性和腫瘤特異性并不能達(dá)到100%，結(jié)果可能受感染或炎癥干擾等。ctDNA作為監(jiān)測疾病進(jìn)展及預(yù)后的工具，相比于PSA，其半衰期短，檢測結(jié)果所受干擾小，能及時(shí)反映與病情相關(guān)的基因信息，準(zhǔn)確性高，可作為全新的生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語

目前，ctDNA應(yīng)用于mCRPC尚未廣泛納入臨床實(shí)踐，主要仍集中于基因組分析及耐藥性機(jī)制研究。ctDNA還可用于疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，或用于前列腺癌的早期篩查和診斷以及開發(fā)新的治療手段。主要挑戰(zhàn)在于ctDNA的檢測率、NGS及ddPCR等技術(shù)檢測的敏感性仍不足以充分應(yīng)用于臨床，特別是在疾病早期階段，ctDNA的檢測率可能較低。此外，昂貴的價(jià)格也是這些技術(shù)投入使用所面臨的難題。