腦脊液miRNA-22 水平對兒童細菌性腦膜炎的早期診斷及療效分析

林碧惠 簡詠芬 蔡艷 范徐威 楊燕華 王翠敏

腦膜炎是中樞神經系統(tǒng)受細菌、真菌、病毒等感染后出現(xiàn)的軟腦膜組織的彌漫性炎性疾病，根據致病因素的不同，可分為細菌性腦膜炎、結核性腦膜炎、病毒性腦膜炎和真菌性腦膜炎[1,2]。在兒童腦膜炎患者中，以細菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎最為常見，真菌性腦膜炎發(fā)病率最低[3,4]。腦膜炎患兒在發(fā)病早期通常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐，及不同程度精神、人格或意識改變等，不具備典型性臨床癥狀，且目前的主要診斷手段是依靠腦脊液化學、細菌培養(yǎng)鑒定，以及配合利用頭顱放射影像學、腦電圖等[5]。然而對于腦膜炎患兒，放射學、腦電圖等檢查手段往往不能配合，給診斷帶來一定的障礙。

由于兒童的各類腦膜炎單純依靠臨床表現(xiàn)和早期缺乏細菌培養(yǎng)等檢查結果，無法做出病因診斷，因此臨床早期經驗性選擇抗生素進行治療，對病毒性腦膜炎、結核性腦膜炎及真菌性腦膜炎等不能覆蓋，造成治療方案的錯誤甚至錯過診療的最佳時機，患兒容易留下肢體活動障礙、智力障礙，甚至因治療延誤導致死亡[6]。如何于早期更好地明確兒童腦膜炎的病因類型是目前重點的研究方向。大量研究發(fā)現(xiàn)，細菌、病毒及真菌所致的腦膜炎早期腦脊液的成分就能出現(xiàn)很大的差別，表現(xiàn)在腦脊液蛋白、干擾素、白介素等。近期研究發(fā)現(xiàn)，有系列腦脊液miRNA（如miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155等）在不同病原菌所致的腦膜炎中呈現(xiàn)不同程度的水平及變化趨勢，與結核性腦膜炎有明顯相關性，miRNA-31 與隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎有相關性等[7-9]。miRNA-22 是一種炎癥相關的小分子RNA，本研究圍繞腦膜炎病原學類型鑒別，其在腦脊液中水平與疾病的臨床發(fā)展、診療效果的相關性報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取佛山市南海區(qū)婦幼保健院自2015 年1 月至2018 年3 月收治的82 例腦膜炎患兒和和佛山市第二人民醫(yī)院同期收治的44 例腦膜炎患兒，其中男性65 例、女性61 例，年齡范圍3～15 歲，年齡（8.54±3.52）歲，根據最終診斷結果分為3 組：細菌性腦膜炎組（64 例）、病毒性腦膜炎組（44 例）、結核性腦膜炎組（18 例）。其中，細菌性腦膜炎組中，男性33 例，女性31 例，年齡范圍3～15 歲，年齡（8.48±3.58）歲；病毒性腦膜炎組中，男性24 例，女性20 例，年齡范圍4～15 歲，年齡（8.68±3.51）歲；結核性腦膜炎組中，男性8 例，女性10 例，年齡范圍4～15 歲，年齡（8.39±3.52）歲。各組間患兒在性別構成、年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

二、納入和排除標準

納入標準：（1）入院時均為輕型腦膜炎，無需急救處理；（2）入院時為初診，未經過外院治療。排除標準：（1）合并免疫缺陷性疾病患兒；（2）近半年來有大劑量使用激素類藥物或免疫球蛋白制劑患兒；（3）診斷考慮為混合感染型腦膜炎患兒；（4）重型腦膜炎患兒，需要ICU 治療的。研究各項操作均得到患者家屬的同意并簽字，項目的開展得到了本院醫(yī)學倫理委員會的審批并同意開展。

三、標準治療方案下治療效果分型

細菌性腦膜炎患兒根據治療效果分為3 級：（1）滿意：患者經治療后癥狀明顯改善，第5 天時無明顯不適，一般情況良好；（2）一般：患者經治療后癥狀有較大改善，第5 天時仍有輕微腦膜炎癥狀，一般情況尚可；（3）欠佳：患者經治療后稍有改善，第5 天時仍有輕至中度腦膜炎臨床癥狀，一般情況稍差。

四、腦脊液miRNA-22 的拷貝數(shù)測定

通過腰穿獲得的腦脊液標本5 mL，通過miRVanaTMPARIS 試劑盒（Ambion 公司，美國）提取樣本內總RNA，RNA 的擴增和定量采用生物光譜儀測定。每個樣本通過miRNA-22 特異性引物進行逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR），獲得cDNA，通過RT-PCR 檢測拷貝數(shù)。具體方法如下：使用TRIzol 從腦脊液樣本中提取總RNA，然后使用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR 定量試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司）在PCR 儀器上檢測miRNA-22 的相對表達量。PCR 循環(huán)程序：95℃持續(xù)30 s，隨后95℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)30 s，40 個循環(huán)[10]。

五、統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，2 組組間比較采用兩獨立樣本的t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、3 組患兒不同時間點腦脊液miRNA-22 水平比較及變化趨勢分析

相較于病毒性腦膜炎和結核性腦膜炎患兒，細菌性腦脊液患兒治療前miRNA-22 的拷貝數(shù)明顯更高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細菌性腦膜炎組經過治療后，腦脊液miRNA-22 的水平呈現(xiàn)快速下降的趨勢，且細菌性腦膜炎患者與病毒性腦膜炎、結核性腦膜炎患兒治療后腦脊液miRNA-22 的拷貝值差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 不同病因組腦膜炎患兒腦脊液水平miRNA-22在不同時間點的拷貝數(shù)比較

二、細菌性腦膜炎患者不同治療效果組間miRNA-22 拷貝數(shù)比較

細菌性腦膜炎組患兒入院時腦脊液miRNA-22水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但療效越差患兒入院時miRNA 的水平更高。療效滿意的細菌性腦膜炎患兒的腦脊液miRNA-22 的拷貝數(shù)明顯較療效一般和欠佳的患兒更低，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖2）。說明miRNA-22 水平一定程度上反應了患兒的病情程度。

圖2 細菌性腦膜炎患兒不同療效組間miRNA-22水平比較

討論

兒童中樞神經系統(tǒng)的感染是臨床常見的兒科疾病，尤其是2～4 歲兒童，免疫功能的不完善、病源環(huán)境的接觸容易引起爆發(fā)性腦膜炎發(fā)作，對兒童的身心健康帶來很大的危害。中樞神經系統(tǒng)的感染根據致病菌的不同，主要分為細菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、結核性腦膜炎和真菌性腦膜炎，以細菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎最為常見[11]。其中，細菌性腦膜炎臨床上又稱為化膿性腦膜炎，主要致病菌為化膿性細菌，常見為腦膜炎雙球菌、肺炎球菌和流感嗜血桿菌，通常通過身體其他部位感染經血途徑侵入中樞神經系統(tǒng)，或外傷、顱腦臨近部位如中耳炎、鼻竇炎等化膿性細菌的直接侵犯，少數(shù)情況下因醫(yī)源性操作引起的化膿性細菌侵入等途徑引發(fā)顱內化膿性改變[12]。這類腦膜炎發(fā)病率最高，同時其病死率和治療后后遺癥的發(fā)生率也最高。對于病毒性腦膜炎，常見的致病病毒為腸道病毒，如柯薩奇病毒A/B、脊髓灰質炎病毒和?？刹《荆浯螢閱渭儼捳畈《?、流行性腮腺炎病毒和腺病毒[13]。結核桿菌性腦膜炎顧名思義為特別致病菌結核桿菌引起的腦脊膜、蛛網膜的炎癥反應[14]。真菌性腦膜炎是由真菌感染引起的，中樞神經系統(tǒng)真菌感染引起的腦脊髓蛛網膜炎癥通常同時合并有腦實質病變，其發(fā)病率相對較低，但目前臨床上抗生素的濫用、大量激素的不規(guī)范使用及艾滋病高發(fā)導致真菌性腦膜炎的發(fā)病率逐年增高[15]。各類病原菌所致的小兒腦膜炎發(fā)病的早期通常均表現(xiàn)為發(fā)熱，精神、意識改變，頭痛、惡心、嘔吐等，無明顯特征，對病因學診斷無明顯幫助。目前臨床診斷常常需要進行腦脊液的細菌學培養(yǎng)及鑒定，但是獲得結果需要花費時間較長，且病毒性腦膜炎、真菌性腦膜炎等常出現(xiàn)陰性結果[16]。因此，小兒腦膜炎患者早期的治療通常為進行廣譜強力抗生素的覆蓋，以期待達到對發(fā)病率最高的化膿性腦膜炎的控制，然而對真菌性腦膜炎、結核性腦膜炎、病毒性腦膜炎患兒，不可避免地出現(xiàn)耽誤治療的情況。

對腦膜炎患者的早期病原菌型診斷是臨床醫(yī)學科學研究重點重點之一，研究也發(fā)現(xiàn)了大量線索能夠對早期病原菌的分型的確定起到重要指導。外周血白細胞計數(shù)、降鈣素原、C 反應蛋白是常用的炎癥指標，其濃度異常升高對化膿性腦膜炎的診斷有一定的指導意義，但以上指標外界影響因素大，診斷的特異度和敏感度不夠理想，且對非化膿性腦膜炎的病原菌分型的確定無明顯意義[17]。相比較血清學檢查，腦脊液的生化檢查對腦膜炎患者病原菌的診斷意義更加明確。腦膜炎患者因病原菌的不同，腦脊液內蛋白、細胞因子以及病原菌表達的miRNA 等可表現(xiàn)出一定的濃度、變化趨勢的特殊性，為病原學診斷提供了線索[18]。miRNA 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，主要參與基因轉錄后的基因表達調控，通常以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在。其在細胞的增殖、凋亡，細胞的分化、遷移，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等各種生理生化過程中具有重要的作用。在中樞神經系統(tǒng)腦脊液中，也能檢測到miRNA 的存在，且含量的變化與某些疾病有著密切的關系[19]。miRNA-22 在機體內有重要的作用，其高表達能夠改善心肌梗死后心功能情況，也能夠調控髓母細胞的增殖、凋亡，在肝癌等癌細胞中能夠調控惡性進展，在中樞神經系統(tǒng)中，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-22 的水平與中樞神經退行性病變、膠質瘤細胞的遷移有一定關系[20-22]。但目前關于腦脊液miRNA-22 水平與兒童腦膜炎的病原學類型是否有關系尚無明確報道。本研究表明miRNA-22在細菌性腦膜炎患兒腦脊液中的拷貝數(shù)較病毒性腦膜炎、結核性腦膜炎高，在病毒性腦膜炎患兒腦脊液中的拷貝數(shù)最低，且3 組病原菌型患兒經常規(guī)標準抗菌治療后，細菌性腦膜炎患兒腦脊液中的miRNA-22 拷貝數(shù)呈現(xiàn)顯著降低趨勢，而在病毒性腦膜炎、結核性腦膜炎患兒的腦脊液中拷貝數(shù)無明顯變化。通過進一步分析細菌性腦膜炎患兒組內不同治療效果的差異與腦脊液中miRNA-22 拷貝數(shù)的差異變化發(fā)現(xiàn)，治療效果滿意患兒的腦脊液中miRNA-22 的拷貝數(shù)在治療后的下降趨勢顯著大于治療效果一般和欠佳的患者。

綜上所述，腦膜炎患兒腦脊液中miRNA-22 拷貝數(shù)的水平對早期區(qū)分腦膜炎患兒病原菌的類型有一定的參考價值，細菌性腦膜炎患兒腦脊液中的miRNA-22 拷貝數(shù)明顯升高，且miRNA-22 拷貝數(shù)與細菌性腦膜炎患兒的預期治療效果可能存在一定相關性，需進一步研究驗證。