牛傳染性鼻氣管炎病毒部分gB蛋白的原核表達(dá)及抗原性分析

何小麗 李凡飛 王文佳

摘要：為對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）gB基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抗原性分析，利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的gB-BL21重組陽性菌落，進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)條件（IPTG最佳濃度、作用時(shí)間）等影響表達(dá)的因素進(jìn)行優(yōu)化，然后將表達(dá)的gB重組蛋白進(jìn)行親和層析純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果表明，gB蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)蛋白的相對(duì)分子量約為32.4 ku，與預(yù)期的蛋白大小一致。經(jīng)BCA（聚氰基丙烯酸正丁酯）蛋白含量測定試劑盒測定，gB重組蛋白濃度為 1.84 mg/mL。Western Blot結(jié)果顯示，純化后的gB重組蛋白能被標(biāo)準(zhǔn)IBR陽性血清識(shí)別，說明表達(dá)的目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為IBRV檢測的特異性抗原。試驗(yàn)為建立牛傳染性鼻氣管炎診斷方法及研究gB蛋白的功能特性提供了材料和技術(shù)理論支持。

關(guān)鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎;gB蛋白;原核表達(dá);純化;抗原性分析

中圖分類號(hào)：S852.4+3 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0189-04

牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，簡稱IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，簡稱IBRV）[又稱為牛皰疹病毒1型（BHV-1）]感染所引起的高度接觸性傳染病。該病具有廣泛的嗜組織性，在臨床上表現(xiàn)為呼吸道型、生殖道感染型、腦膜腦炎型和流產(chǎn)型4種類型。該病呈世界性廣泛分布，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為二類動(dòng)物傳染病，每年都給全球的養(yǎng)牛業(yè)帶來了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[1]。BHV-1基因組中已被編碼為蛋白的共有73個(gè)開放閱讀框[2]。BHV-1編碼的結(jié)構(gòu)蛋白有33種，其中13種蛋白與核衣殼有關(guān)，10種編碼糖蛋白[3]。gB是在病毒吸附、進(jìn)入細(xì)胞及胞間擴(kuò)散和融合中起著重要作用的主要膜蛋白，也是主要的抗原蛋白，是BHV-1中最保守的蛋白[4]。

我國于1980年從國外進(jìn)口的奶牛中檢測到了引起該病的病毒，自此許多學(xué)者開始對(duì)該病的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明我國國內(nèi)大部分省份已存在較為廣泛的牛傳染性鼻氣管炎病毒的感染且呈現(xiàn)逐年上升的現(xiàn)象。目前，并沒有特效的藥物治療此病，我國主要采取以預(yù)防為主的措施防控此病。本試驗(yàn)通過對(duì)IBRV gB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，旨在獲得IBR高效表達(dá)蛋白，為IBR的檢測方法提供原材料和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 血清與菌株

IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自美國IDEEX公司;牛傳染性鼻氣管炎gB-BL21陽性重組菌株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存。

1.2 主要試劑盒

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;AEC底物顯色試劑盒，購自索萊寶公司;AEC蛋白純化試劑盒，購自凱基生物公司。

1.3 主要試劑

主要試劑如下：瓊脂糖，購自西班牙;異丙基硫代-α-D半乳糖苷（IPTG），Thermo Fisher;氨芐青霉素（AMP），Amresco;瓊脂粉，OXOID;蛋白彩虹marker，Thermo Fisher;十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液（2×），SDS購自西安國安生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250，Thermo Fisher;過硫酸銨，Biotopped;10%SDS;四甲基乙二胺（TEMED），Biotopped;1 mol/L pH值為6.8的Tris-HCl，Tris購自Biotopped;1.5 mol/L pH值為8.8的Tris-HCl;29 ∶ 1的丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺蛋白電泳緩沖液（5×），Biotopped;聚偏氟乙烯（PVDF）膜，Thermo Fisher;濾紙， 沈陽市長城過濾紙板有限公司;甘氨酸，西安國安生物科技有限公司;脫脂奶粉，完達(dá)山乳業(yè);Tween20，Biotopped;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）;無水乙醇，天津市福晨化學(xué)試劑廠;0.22 μm濾膜，Sigma;Rabbit Anti-Bov IgG/HRP[辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG]，Sigma。其他化學(xué)試劑均購自天津市化學(xué)大茂化學(xué)試劑廠。此外，聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白純化試劑盒，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 重組蛋白gB的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化 取1 μL連接好的重組質(zhì)粒PET32a-gB，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)12～15 h。然后用無菌接種棒挑取單個(gè)重組菌落，接種于5 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖床上于 220 r/min 培養(yǎng)12～15 h。取培養(yǎng)的菌液按1 ∶ 50的比例接種于新鮮的LB（AMP+）液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng) 2～3 h，直至D600 nm達(dá)到0.6～0.8，取1.0 mL菌液保存，作為IPTG誘導(dǎo)前樣品，將剩余的菌液分成6管，分別向其中加入不同濃度的IPTG，使其終濃度依次為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol/L，然后置于37 ℃搖床上培養(yǎng)，分別于1、2、3、4、5 h后從5管中各取1 mL誘導(dǎo)菌液，室溫下于8 000 r/min離心 2 min，去上清，采用PBS重懸沉淀，重復(fù)離心，最后棄盡上清，用PBS重懸沉淀，混勻，然后向其中加入2×SDS上樣緩沖液，置于沸水中煮沸5 min，取出后迅速放入冰浴中，適當(dāng)時(shí)間后，放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的檢測 按照說明配制分離膠與濃縮膠，在分離膠上面插入梳子，靜置約30 min，使凝膠完全聚合。然后將玻璃制膠板放入電泳槽中，在電泳槽中加入適量的電泳液，緩慢垂直拔出梳子，用移液器沖洗加樣孔。向第1個(gè)加樣孔中加入蛋白彩虹marker，在相鄰的泳道中依次加入樣品。接通電源，起始電壓為80 V，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，提高電壓至120 V，電泳1 h。待溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽的底部時(shí)，關(guān)閉電源，小心地從玻璃板上剝下凝膠，切掉濃縮膠，并對(duì)分離膠進(jìn)行標(biāo)記，然后將其放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色1 h。結(jié)束后，取出分離膠，將其轉(zhuǎn)入脫色液中脫色，觀察結(jié)果。

1.4.3 重組蛋白的可溶性分析 參照“1.4.1”節(jié)的方法，分別利用蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心，棄上清，在沉淀中加入PBS重懸菌體，混勻。然后超聲裂解菌體細(xì)胞，待菌液變清后，10 000 r/min離心10 min，收集上清，并向沉淀物中加入8 mol/L尿素，充分裂解。然后分別向收集好的上清和沉淀中加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，快速放入冰浴中，適當(dāng)時(shí)間后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4.4 重組蛋白的純化分析 參照“1.4.1”節(jié)的方法，分別利用蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件對(duì)重組蛋白表達(dá)至最優(yōu)的時(shí)間，取50 mL離心管，稱量空管的質(zhì)量并作記錄，倒入誘導(dǎo)的菌液，離心，棄上清，加入去離子水重懸沉淀，再次以同樣的條件離心，倒掉上清，稱量離心管質(zhì)量，得到菌體濕質(zhì)量，每100 mg菌體（濕質(zhì)量）中加入2 mL細(xì)菌裂解液（每毫升細(xì)菌裂解液中預(yù)先加入10 μL蛋白酶抑制劑混合物），超聲破碎20 min，10 000 g低溫離心15 min，收集沉淀，將沉淀重懸于Binding Buffer中，盡量混勻使包涵體充分溶解。20 ℃靜置過夜，次日取出后，使用His（組氨酸）標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行相關(guān)步驟純化，然后對(duì)純化蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE分析。

1.4.5 純化蛋白濃度的測定 使用BCA蛋白純化試劑盒對(duì)重組蛋白含量進(jìn)行測定，具體步驟如下：

（1）按照表1依次向96孔板中加入相應(yīng)試劑;

（2）將試劑盒中的A試劑與B試劑按照1 ∶ 50的比例配制BCA工作液，充分混勻;

（3）依次加入200 μL BCA工作液;

（4）將96孔板放在振蕩器上振蕩數(shù)秒，37 ℃孵育 30 min;

（5）在酶標(biāo)儀上讀取D562 nm，以蛋白含量（μL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;

（6）選取合適的濃度稀釋gB蛋白，使其總體積為20 μL，加入BCA工作液200 μL，混勻，37 ℃放置30 min，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)管作參比，記錄562 nm下的吸光度;

（7）根據(jù)所得樣品的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的蛋白含量，換算到原體積中，記錄蛋白的濃度。

1.4.6 純化蛋白的Western Blot分析 按照上述方法進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，取出凝膠切下分離膠，標(biāo)記方向，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)印，150 mA恒流，4 ℃ 3 h，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。接著取出轉(zhuǎn)有蛋白質(zhì)分子的PVDF膜，采用5%脫脂乳封閉2 h，一抗（IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清）4 ℃雜交過夜，次日取出后使用PBST（加了吐溫的磷酸鹽緩沖液）洗滌5次，加入二抗（Rabbit Anti-Bov IgG/HRP）雜交1 h，去除非特異性結(jié)合，再次洗滌，條件同上。洗滌結(jié)束后，使用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）底物顯色試劑盒顯色 15 min，之后用蒸餾水終止反應(yīng)，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白gB的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

將連接好的重組菌落接種于培養(yǎng)基上，利用IPTG初步探索誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌并沒有出現(xiàn)特異性的條帶，而經(jīng)IPTG于37 ℃ 誘導(dǎo)后的重組菌落出現(xiàn)了特異性的條帶，經(jīng)分析其大小為32.4 ku，與預(yù)期的蛋白分子質(zhì)量大小相符。為提高重組蛋白的表達(dá)效率，為以后大量制備蛋白奠定基礎(chǔ)，分別以不同時(shí)間和不同IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。最后通過SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測，由圖1、圖2顯示，蛋白的表達(dá)量在37 ℃ 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h時(shí)達(dá)到最大值。

2.2 重組蛋白的可溶性分析

分別將重組菌落經(jīng)過最優(yōu)的表達(dá)條件表達(dá)，離心收集沉淀后超聲破碎，再次離心后對(duì)沉淀加尿素溶解，經(jīng)SDS-PAGE分析，由圖3可見，表達(dá)gB蛋白以包涵體的形式存在。

2.3 重組蛋白的純化分析

由圖4可知，根據(jù)gB蛋白的表達(dá)特性和最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行表達(dá)純化，得到1條約為32.4 ku的純度較高的條帶。

2.4 純化蛋白濃度的測定

以BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)、吸光度D562 nm為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5。根據(jù)BSA濃度與D562 nm的線性關(guān)系，得到了擬合曲線方程：y=0.078 6x+0.065 6，r2=0.998 9。經(jīng)測定，gB重組蛋白的濃度為1.84 mg/mL。

2.5 重組蛋白的Western Blot檢測

純化的gB蛋白經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)印、一抗二抗雜交，再經(jīng)AEC顯色之后，出現(xiàn)了1條純度較高的目的條帶（圖6），提示表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

3 結(jié)論與討論

IBR近年來已經(jīng)成為影響牧業(yè)發(fā)展的主要病原，對(duì)于我國而言它屬于外來病原，首次發(fā)現(xiàn)該病在1980年，2005年我國在澳大利亞進(jìn)口種牛中成功分離到該病毒[5]。2006年檢測了來自內(nèi)蒙古等11個(gè)省份的疑似感染IBR血清樣本，結(jié)果顯示抗體陽性率為46.0%[6]。2015年北疆4個(gè)規(guī)?；膛鯥BR感染性抗體的平均陽性率為87.4%[7]。2016年筆者所在團(tuán)隊(duì)對(duì)寧夏地區(qū)進(jìn)行IBR的抗體檢測，平均陽性率高達(dá)85.1%[8]。我國作為奶牛養(yǎng)殖業(yè)大國，但由于我國整體的養(yǎng)牛水平不太高，每年都要從一些養(yǎng)牛水平高的國家進(jìn)口大批的牛，2015年Moore等的研究表明，澳大利亞出口的活牛IBR血清陽性率為39.0%[9]，這些數(shù)據(jù)均表明IBR感染的普遍性和嚴(yán)重性，我們應(yīng)提高警惕避免該病發(fā)生大面積暴發(fā)。

gB蛋白是IBRV主要的抗原蛋白，在機(jī)體的免疫保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用[10]。目前，IBRV的診斷試劑大多數(shù)均針對(duì)gB抗原表位。本研究采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的gB重組菌株，使用大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)以其高效表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)成為近些年來首選的表達(dá)系統(tǒng)[11]。相對(duì)于全基因表達(dá)，gB部分基因表達(dá)克服了蛋白表達(dá)量低、抗原性弱等缺點(diǎn)，目的蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得了大量高效的表達(dá)。在選擇蛋白純化方法時(shí)，采用鎳柱親和層析法，方法簡便、利于操作及實(shí)驗(yàn)室蛋白的大量純化，分離純化效果好，純化后的蛋白經(jīng)免疫印跡檢測，能與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明表達(dá)的gB蛋白具有良好的反應(yīng)活性，可被用來作為IBRV檢測的特異性抗原。

本研究成功獲得了IBRV gB蛋白，為應(yīng)用建立IBR診斷方法和制備gB蛋白多抗和單抗，作為抗原免疫動(dòng)物提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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