釀酒紅曲米特征與產(chǎn)品酸度的相關性分析

林曉姿 任香蕓 何志剛 梁璋成 李維新

（福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術研究所 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室 福州 350003）

黃酒是世界上最古老的三大釀造酒之一，以米制曲、以曲制酒的工藝已在我國傳承了3 000多年。傳統(tǒng)酒曲主要有麥曲、小曲、紅曲、烏衣紅曲等，是以稻米為基質(zhì)在特定生態(tài)環(huán)境下用成曲做母種培養(yǎng)發(fā)酵制成[1]。黃酒釀造行業(yè)存在的主要技術瓶頸之一是產(chǎn)品酸度控制問題，一般將酸度超過7 g/L稱為中度超酸，酸度超過10 g/L稱為酸敗[2]。酒曲質(zhì)量、釀造工藝及陳釀環(huán)境等因子是影響黃酒酸度的主要因素[3]。優(yōu)質(zhì)酒曲是優(yōu)質(zhì)黃酒釀造的首要要求，酒曲富集了曲霉、酵母菌和乳酸菌等多種微生物及其產(chǎn)生的豐富酶系，有“曲是酒之骨”之稱[4]。不同地區(qū)的生產(chǎn)環(huán)境、制備工藝、氣候條件及地理位置等差異形成了酒曲產(chǎn)品的菌群多樣性，如曲霉是產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶等的關鍵菌[5-7]。酵母菌菌群決定了酒曲的酒精發(fā)酵能力，乳酸菌菌群則主導著釀造產(chǎn)品的酸感及風味，不同種屬微生物間存在著競爭、共生、寄生、互營、拮抗等生態(tài)關系[8]。有研究表明，影響麥曲品質(zhì)的兩大主要因素是麥曲中的微生物和蛋白質(zhì)[9]；麩曲基質(zhì)的pH值明顯影響微生物生長，進而影響相關發(fā)酵酶的活力[10]；選擇蛋白質(zhì)含量較低的精米有利于降低終產(chǎn)品高級醇的生成量[11]；紅曲米色價在300～1 000 u/g之間的糖化力及發(fā)酵力比其它色價紅曲米更強[12]，而鮮有對酒曲表征指標與其釀造產(chǎn)品品質(zhì)進行相關性研究的報道。

作為紅曲黃酒主產(chǎn)區(qū)，福建省各區(qū)域都有代表性極強的特色釀酒紅曲米，紅曲米主要以秈米為原料，在開放式環(huán)境中經(jīng)紅曲霉發(fā)酵制成，另有添加“曲公”制成的烏衣紅曲[12]，因季節(jié)、批次、區(qū)域、制作者等不同，所培養(yǎng)的紅曲品質(zhì)難以保持一致，從而使得釀酒質(zhì)量參差不齊。本文旨在通過研究紅曲米表型特征及發(fā)酵特性指標與產(chǎn)品酸度間的相關性，解析釀造黃酒產(chǎn)品酸度的影響因子，為我省酒曲制備及黃酒生產(chǎn)提供產(chǎn)業(yè)技術支撐，為食品工業(yè)用米加工產(chǎn)業(yè)原料高效利用提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 紅曲米樣品

選取福建省各地區(qū)的代表性紅曲米樣品25份：福州市1份、漳州市1份、南平市1份、三明市2份、龍巖市2份、泉州市7份、寧德市11份，詳見表1。

表1 福建省各地區(qū)紅曲米樣品信息Table1 The samples Hongqu rice of Fujian province

1.2 主要試劑和儀器

淀粉酶（AMS）測試盒，南京建成生物工程研究所；其它試劑均為國產(chǎn)AR級；研磨儀，德國IKA公司；恒溫水浴鍋DK-S28型，上海精宏公司；pH計PB-10，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；自動凱氏定氮儀K9840，濟南海能公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵工藝 取5 kg裝陶缸，用蒸汽殺菌30 min，8層紗布封口冷卻，加入2.0 kg凈水，分別加入表1中紅曲米100.0 g，浸泡過夜，次日加入經(jīng)浸泡、蒸煮、攤涼的糯米飯2.0 kg，攪拌混勻，兩層紗布封口后置于（20±2）℃下發(fā)酵，定期攪拌通氣，發(fā)酵30 d結束，壓榨過濾得原酒。各樣品平行處理2次。

1.3.2 檢測指標與方法 分別取適量釀酒紅曲米樣品檢測紅曲 pH 值（X1）、干燥失重（X2）、容重（X3）、淀粉（X4）、蛋白質(zhì)（X5）、總氨基酸（X6）等表觀特征，以及液化力（X7）、糖化力（X8）等發(fā)酵特性，將每份樣品按照1.3.1節(jié)的工藝進行發(fā)酵，檢測發(fā)酵3 d時的發(fā)酵力（X9）及發(fā)酵結束后的產(chǎn)酒力（X10）及酒液總酸（Y）。

1.4 檢測方法

1.4.1 表觀特征 紅曲米容重[12]：將樣品放入1 L量筒，上表面與刻度平行，稱量此時樣品質(zhì)量取2次平行測定結果的算術平均值作為測定結果，以干基計。

紅曲pH值[13]：將樣品碾磨成80目粉末后，精確稱取10.00 g定容至50 mL，60℃水浴0.5 h，離心取上清液檢測。

紅曲米干燥失重[14]：稱取適量樣品，精確至0.0002 g，置于已在（105±2）℃烘至恒重的稱量瓶中，放入（105±2）℃烘箱中烘至恒重，干燥失重為烘干前、后的質(zhì)量變化百分比。

紅曲米蛋白質(zhì)[15]：將樣品碾磨成80目粉末，稱取適量樣品，精確至0.001 g，移入干燥的500 mL定氮瓶中消化至液體呈藍綠色并澄清透明，再用凱氏定氮儀進行酸堿中和滴定，同時做試劑空白試驗。紅曲米的蛋白質(zhì)含量換算成干基計。

紅曲米淀粉[16]：將樣品碾磨成80目粉末，稱取適量樣品，精確至0.001 g，去除脂肪、可溶性糖后采用酸水解法進行檢測，紅曲米的淀粉含量換算成干基計。

紅曲米總游離氨基酸[17]：將樣品碾磨成80目粉末，稱取適量樣品，精確至0.001 g，紅曲米的游離氨基酸含量換算成干基計，計算各游離氨基酸之和。

1.4.2 發(fā)酵特性 液化力[19]：采用淀粉酶（AMS）測試盒，將樣品碾磨成80目粉末，稱取適量樣品，精確至 0.01 g，以磷酸緩沖液（PBS，pH 6.0）為溶劑，定容至50 mL，浸提0.5 h后過濾，收集濾液待用。底物緩沖液先于40℃浴溫5 min后待用。取兩只試管作為空白管和檢測管，分別加入底物緩沖液0.5 mL，檢測管另加樣液0.1 mL，混勻，40℃水浴準確反應7.5 min，分別加入碘應用液0.5 mL，添加蒸餾水3.0 mL混勻，測定OD660nm，1 cm光徑。液化力（U/g）=（OD空白-OD測定）÷OD空白×（0.4×0.5÷10）×（60÷7.5），定義 U 是 1 g樣品在 40℃下與底物作用60 min水解1 mg淀粉為1個單位，結果以干基計。

糖化力[18]：將樣品碾磨成80目粉末，稱取適量樣品，精確至0.01 g，用乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.6）定容至50 mL，浸提0.5 h后過濾，收集濾液，用乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋一定倍數(shù)，待用取兩支50 mL比色管（A、B管），分別加入可溶性淀粉溶液5 mL和乙酸-乙酸鈉緩沖液4 mL，搖勻，于40℃恒溫水浴中預熱5～10 min，在B管中加入待測酶液5.0 mL，立即記時，搖勻，在此溫度下準確反應60 min后，立即向A、B管中各加氫氧化鈉溶液0.2 mL，搖勻，同時將兩管取出迅速冷卻，并于A管中補加待測酶液5.0 mL作為空白對照。吸取上述A、B兩管中的反應液各稀釋一定倍數(shù)，分別取0.5 mL加入1.5 Ml DNS試劑，在沸水浴中加熱5 min后取出迅速冷卻至室溫，加入10 mL蒸餾水，在波長520 nm處測定吸光值。同時制作0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的葡萄糖標準曲線。

糖化力（U/g）=（OD空白-OD測定）÷K×14.2×n÷5，定義1個糖化力單位（U/g）即1 mL酶液在40℃、pH 4.6的條件下，1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖U/g；式中，K——葡萄糖標準曲線斜率；14.2——反應液總體積（mL）；n——稀釋倍數(shù)；1/5——折算成1 mL酶液的量，結果以干基計。

發(fā)酵力[20]：按照1.3.1節(jié)發(fā)酵工藝進行釀造，稱量發(fā)酵起始及發(fā)酵3 d的重量W起始和W3d，發(fā)酵力（%）=（W起始-W3d）÷W原料×100。

產(chǎn)酒力：按照1.3.1節(jié)發(fā)酵工藝進行釀造制備原酒，稱量壓榨所得原酒重量并檢測原酒酒精度，按照酒精度15%（體積分數(shù)，20℃）折算，產(chǎn)酒力（%）＝（W原酒÷W原料）×（酒精度÷15%）×100。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS 17.0版進行描述性統(tǒng)計、因子分析和回歸分析，用*表示在0.05水平（雙側）上顯著相關，用**表示在0.01水平（雙側）上顯著相關。

2 結果與分析

2.1 紅曲米的指標檢測值與描述性統(tǒng)計

25份釀酒紅曲米的10個指標檢測結果見表2，為消除由于度量單位或平均數(shù)不同造成的方差分析效果不明確，對檢測結果進行描述性統(tǒng)計并計算變異系數(shù)，結果見表3。變異系數(shù)最大的是3個發(fā)酵特性參數(shù)，樣品間極值差距較大，即糖化力（X8）、液化力（X7）和發(fā)酵力（X9），其次是產(chǎn)品酸度。由于制備工藝及其附著的微生物菌群特性，紅曲米樣品的物性均偏酸，因此紅曲米pH值（X1）的變異幅度較小。

表2 紅曲米的特征指標Table2 The characteristic parameters of Hongqu

表3 描述性統(tǒng)計Table3 Descriptive statistics

2.2 指標間的相關性分析

各指標間的相關性分析見表4，左下角為相關系數(shù)，右上角為偏相關系數(shù)。從相關性來看，與產(chǎn)品酸度（Y）呈顯著或極顯著正相關的指標有容重（X3）和淀粉（X4），而偏相關系數(shù)并不顯著，說明它們之間的正相關夾雜著其它變量混有的正效應；呈顯著或極顯著負相關的是紅曲pH值（X1）和發(fā)酵力（X9）。從偏相關性來看，與產(chǎn)品酸度（Y）呈顯著或極顯著正相關的指標是液化力（X7），而呈顯著或極顯著負相關的是紅曲pH值（X1）、蛋白質(zhì)（X5）、發(fā)酵力（X9）和產(chǎn)酒力（X10）。綜合相關性及偏相關性來看，對產(chǎn)品酸度（Y）均呈顯著或極顯著相關的指標是紅曲 pH 值（X1）和發(fā)酵力（X9）。 紅曲pH 值（X1）和液化力（X7）、總氨基酸（X6）和糖化力（X8）、液化力（X7）和發(fā)酵力（X9）之間的相關性及偏相關性也均呈顯著或極顯著正相關，這與唐玉明等[20]的研究認為瀘州老窖成品曲酒化力與發(fā)酵醪酸度呈顯著負相關一致。

表4 各指標間的相關性Table4 The correlation between the characteristic parameters

2.3 產(chǎn)品酸度的多元回歸分析

為進一步解析各影響因子與釀造酸度間的關系，選取與產(chǎn)品酸度（y）相關性或偏相關性顯著的因子紅曲 pH（x1）、容重（x2）、淀粉（x3）、蛋白質(zhì)（x4）、液化力（x5）、發(fā)酵力（x6）及產(chǎn)酒力（x7）進行多元逐步回歸分析，得到方程：y=-206.6614+40.55114x1+8.9631x6+1.16790x7+0.1086x1x5-0.9471x1x6-0.2151x1x7-0.0002x2x3+0.0002x2x5+0.0244x3x5-0.0768x3x6+0.0264x4x5-0.1749x4x6+0.0233x5x6-0.0101x5x7（R=0.9894，P=0.0001），該方程可用于產(chǎn)品酸度的預測。各因子項的方差分析見表5，x2x5不顯著，x1x5、x1x6、x2x3為顯著項，其它 10 項均為極顯著項，說明紅曲 pH 值（x1）、發(fā)酵力（x6）、產(chǎn)酒力（x7）是影響產(chǎn)品酸度（y）的重要單因子，這與相關性分析結果相印證。

2.4 產(chǎn)品酸度的單因子回歸分析

基于多元回歸分析結果，選取紅曲pH值、發(fā)酵力、產(chǎn)酒力分別與產(chǎn)品酸度進行單因子回歸分析，結果見表6。產(chǎn)品酸度與3個影響因子的回歸方程分別為：Y=285.218-118.540X+12.689X2、Y=13.214e-0.069X、Y=76.286e-0.011X，其中產(chǎn)品酸度與紅曲pH值和發(fā)酵力的方程達極顯著水平，與產(chǎn)酒力達顯著水平。

表5 各因子項的方差分析Table5 Variance analysis of factors

表6 單因子與產(chǎn)品酸度的方差分析Table6 Variance analysis between the single factor and the product acidity

3 討論與結論

1）釀酒紅曲米主要以秈米為發(fā)酵基質(zhì)，采用開放式培養(yǎng)制備工藝，因此含有復雜多樣的微生物體系，如霉菌（紅曲霉、黑曲霉、根霉等）、酵母菌、細菌（芽孢菌、乳酸菌和醋酸菌等）等[21-22]，是影響紅曲米液化力、糖化力及發(fā)酵力等釀造特性的重要內(nèi)在原因，這可從描述性統(tǒng)計分析得到驗證，液化力、糖化力及發(fā)酵力等發(fā)酵特性指標的變異幅度大于50%，說明不同釀酒紅曲米樣品發(fā)酵特性各具地域特色。而紅曲pH值、干燥失重、容重、淀粉、蛋白質(zhì)、總氨基酸等表觀特征指標及產(chǎn)酒力主要取決于發(fā)酵基質(zhì)米的營養(yǎng)成分與添加使用量，因此其變異幅度不大。干燥失重與其它因子的相關性及偏相關性均不顯著，可能是因為樣品理化指標已換算為干基計。

2）綜合相關性及偏相關性來看，均呈顯著或極顯著負相關的指標有：產(chǎn)品酸度與紅曲pH值、產(chǎn)品酸度與發(fā)酵力；均呈顯著或極顯著正相關的指標有：紅曲pH值和液化力、總氨基酸和糖化力、液化力和發(fā)酵力。現(xiàn)有研究認為，黃酒發(fā)酵醪酸敗的根本原因是產(chǎn)酸微生物大量增殖[2-3]。酒曲酸度主要來源于產(chǎn)酸微生物代謝所產(chǎn)生的醋酸、乳酸和琥珀酸等[23]，紅曲pH值低說明醋酸菌、乳酸菌等產(chǎn)酸菌活躍，反之則是酵母菌或霉菌等占優(yōu)勢。霉菌能直接利用生淀粉和粗蛋白[9]，霉菌菌群活躍則紅曲米液化力提高，發(fā)酵基質(zhì)糯米的淀粉、蛋白、粗纖維等不可溶性營養(yǎng)成分快速轉(zhuǎn)化為可溶性的碳氮源[24]，進一步促進了酵母菌快速發(fā)酵并抑制雜菌，表現(xiàn)為前期發(fā)酵力顯著提高，由此保證了產(chǎn)品較低的酸度，這與前人的研究結果一致[25]。因此，要獲得較低酸度的紅曲釀造產(chǎn)品，應選用弱酸性即pH略高的釀造紅曲米，并采用適宜發(fā)酵工藝以提高紅曲米的液化力及前期發(fā)酵速度。

3）剔除不顯著項后，產(chǎn)品酸度（y）與紅曲pH值（x1）、容重（x2）、淀粉（x3）、蛋白質(zhì)（x4）、液化力（x5）、發(fā)酵力（x6）及產(chǎn)酒力（x7）的回歸方程為：y=-206.6614+40.55114x1+8.9631x6+1.16790x7+0.1086x1x5-0.9471x1x6-0.2151x1x7-0.0002x2x3+0.0244x3x5-0.0768x3x6+0.0264x4x5-0.1749x4x6+0.0233x5x6-0.0101x5x7（R=0.9894，P=0.0001），該方程達極顯著性水平，可用于預測紅曲釀造產(chǎn)品酸度。產(chǎn)品酸度與紅曲pH值、發(fā)酵力、產(chǎn)酒力的單因子模型均呈顯著或極顯著水平，都是影響產(chǎn)品酸度的重要因子。結合相關性分析來看，產(chǎn)酒力與產(chǎn)品酸度呈負相關，可能與紅曲中酵母菌有關。本實驗室前期研究結果表明[26]，當酵母菌通過EMP途徑代謝及乙醇脫氫酶（ADH）作用下代謝生產(chǎn)越多的乙醇，其代謝副產(chǎn)物有機酸的產(chǎn)量越低。