眼后節(jié)給藥屏障研究進展

陳雪峰,梁麗娜

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy,DR）、視網(wǎng)膜色素變性（retinal pigmentosa,RP）、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）等視網(wǎng)膜疾病是常見的致盲性疾病，有報道顯示DR 和AMD 的發(fā)病率近年來增長迅速[1-2]。藥物治療仍然是上述致盲性眼病的主要治療方法和研究趨勢，主要給藥途徑包括玻璃體腔注射、靜脈給藥、視網(wǎng)膜下注射、眼周注射、經(jīng)結(jié)膜給藥等，但由于眼內(nèi)存在復(fù)雜的生理和解剖屏障，導(dǎo)致藥物很難在視網(wǎng)膜達到有效劑量，從而影響了藥物的療效。近十年人們通過體內(nèi)及體外實驗對眼后節(jié)的給藥屏障做了大量研究，希望能夠找到更有效的給藥方法。本文根據(jù)不同給藥途徑綜述如下。

1 玻璃體腔注射

玻璃體腔內(nèi)注射是抗VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體是目前最常用的給藥方法之一，其優(yōu)勢表現(xiàn)在可以直接越過數(shù)個屏障、操作步驟簡單及相對安全?；谶@些優(yōu)勢，玻璃體腔注射作為許多新藥臨床試驗的主要給藥途徑[3]。但藥物是否能在視網(wǎng)膜達到有效的治療劑量仍然取決于是否能通過玻璃體及內(nèi)界膜屏障[4]。

1.1 玻璃體的屏障作用

來自玻璃體屏障作用包括兩個方面：一是玻璃體本身結(jié)構(gòu)形成的靜態(tài)屏障，二是玻璃體流動過程形成的動態(tài)屏障（圖1）。

Sakamoto 等[5]發(fā)現(xiàn)玻璃體切割術(shù)后病毒載體通過玻璃體的作用增強了，提示玻璃體是藥物擴散的解剖屏障。非病毒載體的滲透也受到玻璃體凝膠組織的阻礙[4]，研究發(fā)現(xiàn)載體所帶的電荷對擴散作用有明顯影響，比如帶負電荷的納米材料比帶正電荷的更容易穿過玻璃體組織[6]。

關(guān)于粒子大小對穿透性的影響研究結(jié)果不太統(tǒng)一,Xu 等[7]估算牛眼玻璃體的間隙大約在（550±50）nm 左右，并證實了1 μm 大小的顆粒不能順利通過間隙。但與之相反,Martens 等[8]卻發(fā)現(xiàn)帶負電荷的1 μm 顆?？梢皂樌ㄟ^相同條件下的間隙。雖然研究結(jié)果不一致，但上述研究提示大多數(shù)分子及抗體可以通過玻璃體腔，比如用于基因治療的納米粒子大小多在10～500 nm 之間，因此玻璃體靜態(tài)屏障不是影響藥物擴散的主要障礙。

玻璃體流動形成的動態(tài)屏障對擴散性好的微小藥物影響很小，但對于大分子、擴散性差的藥物有明顯的阻礙作用[9-11]。動態(tài)屏障的形成一方面來自于玻璃體前后壓力差引起的玻璃體流動，另一方面是由于眼球的運動所引起，后者對藥物擴散的影響更難預(yù)測，目前的結(jié)果大多基于玻璃體替代物研究[12-13]。

1.2 內(nèi)界膜的屏障作用

現(xiàn)在有很多關(guān)于內(nèi)界膜（internal limiting membranes，ILM）在基因治療視網(wǎng)膜疾病過程中屏障作用的報道，Dalkara等[14]發(fā)現(xiàn)采用蛋白酶對小鼠ILM 進行溫和的消化后，腺病毒相關(guān)血清轉(zhuǎn)運率明顯提高。其他觀察也顯示與健康的ILM 相比，當(dāng)ILM 因視網(wǎng)膜疾病遭到破壞時，載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力得到很大改善[15-16]。在轉(zhuǎn)運過程中，載體通過與ILM 上結(jié)合位點的相互作用增加其在玻璃體視網(wǎng)膜界面的累積，進一步擴散到視網(wǎng)膜進行基因表達[14-15,17-19]。Boye 等[19]發(fā)現(xiàn)肝素硫酸鹽與載體衣殼的結(jié)合在此過程中起著至關(guān)重要的作用。

ILM 對非載體粒子的屏障作用主要與所帶電荷有關(guān)，對嚙齒類動物來講，粒子大小的影響并不明顯[20]。帶負電荷的20 kDa 大小的葡聚糖可以順利通過ILM[21]，同樣大小的帶正電的粒子則被ILM 阻擋,即使2000 kDa 大小的帶負電粒子也比20 kDa 的帶正電粒子更有效地穿透至牛的視網(wǎng)膜中。

2 視網(wǎng)膜下注射

視網(wǎng)膜下注射是將藥物注射到感光細胞層和視網(wǎng)膜色素上皮細胞層（retinal pigment epithelium，RPE）之間，注射后會造成150 μm 的間隙，可引起視網(wǎng)膜脫離和視網(wǎng)膜細胞死亡。雖然該治療方式風(fēng)險較大，但通過這個方式可直接將治療藥物送至靶組織視網(wǎng)膜，因此，視網(wǎng)膜下注射目前仍然是基因治療和干細胞治療的主要手段并有一些成功的報道[22-23]。

視網(wǎng)膜下注射給藥幾乎克服了眼后節(jié)給藥的所有屏障，該給藥途徑的屏障來自視網(wǎng)膜本身[24]。最近，Tao 等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)核層和外核層是主要的擴散屏障。除了細胞本身形成的物理屏障阻礙藥物擴散外，視網(wǎng)膜內(nèi)某些細胞成分也可能與治療藥物產(chǎn)生相互作用，這些成分存在于感光細胞的基質(zhì)中以及RPE 細胞的表面，與治療藥物結(jié)合后阻斷藥物進一步向靶細胞擴散[21]。這可能是視網(wǎng)膜下注射后基因的表達往往局限于視網(wǎng)膜外層和RPE 層的原因[26]。

3 靜脈注射

靜脈注射是一種應(yīng)用廣泛的臨床給藥方式，比如靜脈滴注激素治療葡萄膜炎，靜脈滴注抗生素治療眼內(nèi)炎[27]等，經(jīng)靜脈注射后藥物在視網(wǎng)膜上的生物利用度小于5%[28]。因此，靜脈注射需要更高的濃度來達到相應(yīng)的治療效果，從而增加了副作用的可能性。血-視網(wǎng)膜屏障（blood retinal barrier，BRB）是藥物通過血運途徑到達視網(wǎng)膜的主要障礙。

BRB 包括內(nèi)血-視網(wǎng)膜屏障（inner blood retinal barrier，i-BRB）和外血-視網(wǎng)膜屏障（outer blood retinal barrier，oBRB）兩部分，iBRB 由muller 細胞間的緊密連接組成，oBRB 由RPE細胞的緊密連接組成（圖2）。由于脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮之間空隙較大，允許像蛋白質(zhì)這樣的大分子物質(zhì)通過，因此，脈絡(luò)膜血管層不是藥物眼內(nèi)擴散的障礙。

圖1 玻璃體及內(nèi)界膜示意圖。內(nèi)界膜具有細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成間充質(zhì)細胞的基底膜。玻璃體凝膠是由不同類型膠原纖維網(wǎng)絡(luò)形成的，網(wǎng)絡(luò)間充滿透明質(zhì)酸。ILM：內(nèi) 界 膜；M：muller 細胞端足；G：ganglion 細胞

圖2 視網(wǎng)膜和血視網(wǎng)膜屏障（BRB）示意圖。NFL：神經(jīng)纖維層；GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；PRS：光感受器段；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮。1：神經(jīng)節(jié)細胞；2：星形膠質(zhì)細胞；3：放射狀膠質(zhì)細胞；4：無長突細胞；5：水平細胞；6：雙極細胞；7：感光細胞。iBRB 是由視網(wǎng)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細胞與膠質(zhì)細胞間的緊密連接形成的。oBRB 由RPE 細胞之間的緊密連接構(gòu)成

脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜之間的大分子轉(zhuǎn)移主要受RPE 細胞間的緊密連接影響，連接復(fù)合體并不是靜態(tài)的結(jié)構(gòu)，而是處于打開和關(guān)閉交替的動態(tài)過程。除外被動擴散通過緊密連接，轉(zhuǎn)運途徑還包括借助泵的主動運輸以及囊泡的胞吞轉(zhuǎn)運[29]。有報道顯示，如果分子足夠?。ǎ?.4 nm）則可以自由通過緊密連接的孔隙擴散，大于0.4 nm 的分子主要通過連接結(jié)構(gòu)的開合來進行擴散[30]。一系列通過離體牛脈絡(luò)膜-RPE 復(fù)合體的研究顯示，從20 kDa 到80 kDa 不同大小熒光素標(biāo)記葡聚糖的通透性隨著分子量增大急劇下降[31]。除了大小、分子的親水性及所帶的電荷對通透性也有影響，Pitk?nen 等[31]測試了相同大小的β-阻滯劑的通透性,發(fā)現(xiàn)親脂性越強,越能有效地穿過iBRB，親水性越強則越難通過屏障，oBRB 和i-BRB 這一趨勢十分相似[32]?？傮w來說，小的親水性物質(zhì)主要通過細胞間的緊密連接進行擴散，而親脂性物質(zhì)主要通過跨細胞的轉(zhuǎn)運途徑[31]。另一種屏障作用來自RPE 細胞和iBRB內(nèi)皮細胞上的P-糖蛋白，這種糖蛋白有著外流泵的作用，可以將藥物重新泵回血液，因此，今后的藥物研制要考慮如何避免被這種外流泵識別或者與協(xié)同應(yīng)用外流泵抑制劑[33]。對于以納米微粒為載體的藥物來講，納米粒的大小對藥物的通透性有明顯影響。Kim 等[34]給小鼠靜脈注射100 nm 和20 nm的金納米顆粒，僅在視網(wǎng)膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)了20 nm 的納米粒。但有研究顯示經(jīng)抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體修飾后，由質(zhì)粒介導(dǎo)的85 nm 脂質(zhì)體可以順利通過BRB 進入視網(wǎng)膜。

4 脈絡(luò)膜上腔注射

脈絡(luò)膜上腔（suprachoroidal space，SCS）注射是將藥物注射到脈絡(luò)膜和鞏膜之間，在注射的壓力下脈絡(luò)膜和鞏膜間會出現(xiàn)縫隙，體積會到達200 μl[35]。脈絡(luò)膜上腔注射和其他途徑一樣可以規(guī)避許多屏障，比眼前節(jié)注射和靜脈注射具有更高的生物利用度[36]。

SCS 注射根據(jù)靶組織不同藥物需要克服的屏障亦不相同，如果治療視網(wǎng)膜疾病，藥物需要通過脈絡(luò)膜和RPE 層，治療脈絡(luò)膜疾病，高脈絡(luò)膜環(huán)流則是藥物擴散潛在的主要障礙[3,37-38]。

脈絡(luò)膜的屏障作用表現(xiàn)在兩個方面，一方面作為分子篩限制大分子藥物進入，另一方面來自脈絡(luò)膜豐富的血流對藥物的清除作用。既往許多研究已經(jīng)觀察了脈絡(luò)膜對小分子、大分子以及顆粒的通透性，Tyagi 等[39]發(fā)現(xiàn)與眼周注射和玻璃體腔注射相比，通過脈絡(luò)膜上腔注射氟化鈉進入視網(wǎng)膜的速度更快，濃度更高。物質(zhì)進入眼后節(jié)的擴散性依賴于分子量大小，將4 kDa 和40 kDa 熒光標(biāo)記葡聚糖注射到家兔SCS內(nèi)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜和玻璃體內(nèi)4 kDa 的葡聚糖濃度明顯高于40 kDa[40]，本研究同時觀察了不同親脂力β 阻滯劑在視網(wǎng)膜和玻璃體的分布，發(fā)現(xiàn)親脂性越高分布越多，其機制可能是與結(jié)合位點的細胞膜及黑色素親脂化合物相互作用所致。對于納米顆粒和大分子來講，不僅理化性質(zhì)對其擴散和分布有影響，注射部位也會影響其生物利用度，Chiang 等[41]發(fā)現(xiàn)在兔眼后睫狀動脈一側(cè)注射的顆粒不能擴散到另外一側(cè)。

與靜態(tài)屏障相比，脈絡(luò)膜血流循環(huán)形成的動態(tài)屏障對藥物眼內(nèi)分布影響更大，目前已有許多相關(guān)研究報道[35]。Abarca等[42]采用豬眼體外實驗觀察證實，經(jīng)SCS 注射高親水性藥物后，非灌注眼比灌注眼的藥物分布要高，但親脂性藥物差異不明顯。另有許多研究也發(fā)現(xiàn)熒光素標(biāo)記的不同分子量葡聚糖、貝伐單抗及氟化鈉注射后通常在幾個小時內(nèi)很快被清除[35,39,43]，而20 nm～10 um 的非降解顆粒注射后2 個月還可以在脈絡(luò)膜上腔檢測到[43]，上述研究提示納米及大分子給藥系統(tǒng)持續(xù)釋放可以避免被快速清除，因此具有很大的研究潛力和應(yīng)用前景。

5 眼周注射

眼周注射用于臨床已經(jīng)很久，包括結(jié)膜下注射、球旁注射、球后注射等，侵入性較玻璃體腔注射小，但傳統(tǒng)認為通過該途徑藥物到達視網(wǎng)膜的濃度很低[44]，不但需要克服鞏膜、脈絡(luò)膜、RPE 層等靜態(tài)屏障，還要克服脈絡(luò)膜血流和鞏膜血流等動態(tài)屏障及這些屏障之間相互作用，屏障功能還和藥物的性質(zhì)相關(guān)[45]。下面主要討論鞏膜的屏障作用，其他屏障已在前面部分敘述。

鞏膜的致密結(jié)構(gòu)形成了藥物擴散至眼內(nèi)的物理屏障，藥物能否通過鞏膜纖維網(wǎng)狀組織很大程度取決于其分子量的大小，分子量越大越難通過，同時大分子物質(zhì)的清除率也比小分子低得多[45]。藥物所帶的電荷對其通透性也有一定影響,在生理環(huán)境下帶負電荷[46]。如果大分子物質(zhì)帶有較多負電荷，則可能由于電荷排斥作用而抑制通透性。僅次于分子量大小和電荷的影響因素是親脂性，親脂性物質(zhì)比親水性物質(zhì)更不容易透過鞏膜，這可能是由于鞏膜水化蛋白多糖的特性決定的[47]。而對于親水性藥物來說其脈絡(luò)膜生物利用度通常很低，因為大部分藥物會在脈絡(luò)膜的血流中被清除[46]。眼周注射后藥物能否成功到達視網(wǎng)膜取決于多種因素之間的平衡，較小的微粒容易穿透各層屏障到達視網(wǎng)膜，但注射后會被迅速清除，大顆粒物質(zhì)注射后可以較長時間存留，但不容易穿透各層屏障[3,48-49]，因此，目前藥物轉(zhuǎn)運方法傾向于采用緩釋系統(tǒng)將納米或微粒物質(zhì)釋放至眼內(nèi)[3,49]。另外，不同物種間鞏膜厚度相差很大，這對鞏膜的通透性有直接影響，Nicoli 等[50]發(fā)現(xiàn)豬鞏膜的厚度是人鞏膜厚度的2 倍，人比豬的鞏膜通透性要高3 倍，相反，兔子的鞏膜厚度只有人的一半，這一點在研究中應(yīng)予以考慮。

6 經(jīng)結(jié)膜給藥

采用滴眼液給藥是最方便、安全的眼部給藥方式，但由于淚液的稀釋、角膜、結(jié)膜等眼表的屏障作用、晶體、玻璃體的阻擋作用以及血眼屏障的存在，傳統(tǒng)觀點認為滴眼劑在眼前部組織中濃度高，但是很難在眼后節(jié)尤其是視網(wǎng)膜達到有效的治療濃度。從理論上來講，滴眼劑藥物到達視網(wǎng)膜的途徑有兩個：一個是通過角膜途徑，另外一個是結(jié)膜途徑。結(jié)膜上皮較角膜具有更高的可滲透性，同時其表面積數(shù)倍于角膜，即使是親水性藥物和大分子藥物同樣可較好地滲透結(jié)膜[51-52],目前該途徑得到越來越多的關(guān)注。OZAKI 等[53]發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制肽滴眼液可以通過該途徑到達視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織，這一結(jié)果提示采用滴眼劑給藥方式治療眼后節(jié)疾病的可能。

圖3 各給藥途徑總覽

最近有研究眼部滴眼液治療視網(wǎng)膜疾病的報道。Yamaguchi M 等[54]發(fā)現(xiàn)0.8% ripasudil 滴眼液可以明顯改善視網(wǎng)膜血流灌注；Vigneswara V 等[55]將相同濃度的色素上皮衍生因子按每天滴眼和每周玻璃體注射進行對比，發(fā)現(xiàn)滴眼劑組比玻璃體注射組具有更好的神經(jīng)節(jié)細胞保護作用。因此，雖然是最傳統(tǒng)的給藥方式，滴眼液在眼底病治療方面仍有非常好的前景。

7 小結(jié)

綜上所述，不同給藥途徑對藥物到達眼后節(jié)形成不同的生理及物理屏障（圖3），除化學(xué)藥物及生物制劑外，中藥制劑亦是亟待開發(fā)的寶庫,但中藥在眼內(nèi)的有效濃度、在各屏障的通透特點以及如何提高通透率目前所知甚少。因此，加強眼內(nèi)屏障的研究，尋找更有效的給藥方法和給藥途徑，尤其是加強中藥眼用制劑的研究將是我們下一步的努力方向。