藏紅花素抑制過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡

李姚，王健

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)屬于視網(wǎng)膜退行性疾病，該病病理學(xué)發(fā)生基礎(chǔ)為視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)細(xì)胞[1]。RPE 細(xì)胞為單層柱狀細(xì)胞，容易受到周圍環(huán)境影響，RPE 細(xì)胞損傷后可引起光感受器變性、視網(wǎng)膜變薄[2]。藏紅花素（Crocin）是從藏紅花植物莖中提取的單體化合物，具有抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、保護神經(jīng)細(xì)胞等作用[3]。已有學(xué)者將其應(yīng)用于眼部，發(fā)現(xiàn)藏紅花素能提高視網(wǎng)膜抗氧化能力、抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善視網(wǎng)膜微循環(huán)的作用[4]。本文擬通過采用體外高氧條件下培養(yǎng)RPE 細(xì)胞，初步探討藏紅花素對H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPE 細(xì)胞(美國ATCC 公司)，藏紅花素(美國Sigma 公司，純度＞99%)，二甲基亞砜、H2O2（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州四季青公司)、MTT 試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，Annexin-V/PI 試劑盒及H2DCFDA 熒光探針 (美國BD 公司)，Bcl-2 及Bax抗體（上海碧云天公司）。

1.2 RPE 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RPE 細(xì)胞培養(yǎng) 將RPE 細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，每3d 傳代1 次，取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

RPE 細(xì)胞分組 細(xì)胞接種于96 孔板中，共分4 組，每組5 個復(fù)孔。（1）對照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；（2）氧化損傷組：培養(yǎng)液內(nèi)H2O2濃度為300 μmol·L-1；（3）藏紅花素組：加入藏紅花素作用24 h之后，加入300 μmol·L-1H2O2溶液作用12 h，依藏紅花素濃度不同分為2 個亞組(10 μmol·L-1及100 μmol·L-1)。

1.3 MTT 法測定細(xì)胞增殖

RPE 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔200μl，細(xì)胞密度為1×104個/L，向各孔細(xì)胞中加入10μlMTT(5 g·L-1)，4 h 后吸出上清液，加入100 μL DMSO 溶液，輕微振蕩10 min 后測定各孔570 nm 的光密度值（OD）。細(xì)胞增殖率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測RPE 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）表達(dá)

RPE 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，0.1%胰酶（不含EDTA）消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min離心后收集細(xì)胞，加入5 μL H2DCFDA 染料后置于暗室內(nèi)避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 表達(dá)量變化。

1.5 Annexin V/PI 流式檢測細(xì)胞凋亡

0.1%胰酶（不含EDTA）消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min 離心后收集細(xì)胞，分別加入5μLAnnexin-V 和10μLPI 染料后充分混勻避光反應(yīng)15 min，于1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blot 法檢測RPE 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 及Caspase-9 的蛋白表達(dá)

提取蛋白質(zhì)后上樣，電泳，聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉12 h，加入相應(yīng)抗體，ECL 化學(xué)發(fā)光法自顯影，用Bio-Rad Quantity One 軟件分析電泳結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用LSD-t 檢驗，各處理組組間比較采用兩因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度藏紅花素對RPE 細(xì)胞活力的影響

MTT 法檢測結(jié)果顯示（表1），對照組RPE 細(xì)胞存活率為98.33%±4.90%，氧化損傷組RPE 細(xì)胞存活率為43.12%±3.39%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=48.08，P＜0.05），不同濃度藏紅花素干預(yù)后，RPE 細(xì)胞存活率分別提高到61.76%±4.76%和77.67%±4.43%，與氧化損傷組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F低=40.89，F(xiàn)高=90.33，均P＜0.05）。

表1 MTT 法檢測藏紅花素對H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞存活率的影響（±s）

表1 MTT 法檢測藏紅花素對H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞存活率的影響（±s）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；# 與氧化損傷組比較，P＜0.05

2.2 RPE 細(xì)胞內(nèi)ROS 改變

流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，氧化損傷組RPE 細(xì)胞內(nèi)DCF 熒光信號明顯增強，表明細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重，不同濃度藏紅花素干預(yù)后，DCF 熒光信號強度逐漸減弱，表明藏紅花素抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，改變了RPE 細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)（圖1）。

2.3 藏紅花素抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果表明（表2、圖2），與對照組（4.33%±2.50%）比較，氧化損傷組RPE 細(xì)胞凋亡率明顯升高（F=89.02，P＜0.05），隨著藏紅花素作用濃度的遞增，H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡率呈劑量（10 μmol·L-1及100 μmol·L-1）依賴性遞減（39.00%±3.77%、18.00%±3.80%），與氧化損傷組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F低=192.40，F(xiàn)高=95.76，均P＜0.05）。

2.4 藏紅花素抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號通路的影響

與對照組相比，H2O2抑制RPE 細(xì)胞中抗信號分子Bcl-2 的表達(dá)，促進(jìn)RPE 細(xì)胞中促凋亡信號分子Bax 的表達(dá)。經(jīng)過藏紅花素處理后，Bcl-2 的表達(dá)升高，Bax 的表達(dá)下降（圖3、圖4）。

3 討論

視網(wǎng)膜特別容易受到氧化損傷影響，高濃度的多不飽和脂肪酸、持續(xù)的光照及密集的氧代謝產(chǎn)物促進(jìn)了視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成[5]。體外補充抗氧化劑來維持視網(wǎng)膜的功能不失為一種防治視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷的有效方法。藏紅花素分子式為C44H64O24，分子量為977.21 kD，抗氧化作用明顯。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藏紅花素具有保護神經(jīng)細(xì)胞功能、降低胰島素抵抗、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、治療慢性胃病、預(yù)防心血管疾病發(fā)生的功效[6-7]。近年來，一些學(xué)者將藏紅花素應(yīng)用于體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，均顯示了藏紅花素有效的清除羥自由基、超氧自由基及抗凋亡作用。郭斌[4]發(fā)現(xiàn)藏紅花素通過抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS 的表達(dá)，保護視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞。呂伯昌[8]認(rèn)為藏紅花素能有效抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，其作用機制與影響Ca2+內(nèi)流有關(guān)。

本實驗中，我們使用300 μmol·L-1H2O2建立了RPE 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，觀察藏紅花素對RPE 細(xì)胞的保護作用。結(jié)果顯示，300 μmol·L-1H2O2引起RPE細(xì)胞活力降低，10 μmol·L-1及100 μmol·L-1藏紅花素作用于RPE 細(xì)胞后，RPE 細(xì)胞增殖率隨藏紅花素濃度的升高而升高，證實了藏紅花素對RPE 的保護作用。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測RPE 細(xì)胞內(nèi)ROS 改變。1A 對照組；1B 氧化損傷組；1C 藏紅花素低濃度組；1D 藏紅花素高濃度組

圖2 藏紅花素對H2O2 誘導(dǎo)RPE 細(xì)胞凋亡影響。2A 對照組；2B 氧化損傷組；2C 藏紅花素低濃度組；2D 藏紅花素高濃度組

圖3 藏紅花素對RPE 細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Bax 表達(dá)的影響（電泳圖）

表2 流式細(xì)胞儀檢測藏紅花素對H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡率的影響（±s）

表2 流式細(xì)胞儀檢測藏紅花素對H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡率的影響（±s）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；# 與氧化損傷組比較，P＜0.05

圖4 藏紅花素對RPE 細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 及Bax 表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激在AMD 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，H2O2生成的ROS 導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和上皮細(xì)胞損傷，與AMD 發(fā)生機制相似[9-10]。本實驗中，我們使用流式細(xì)胞儀分別檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS 生成量及細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明，H2O2促進(jìn)了RPE 細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成和細(xì)胞凋亡，藏紅花素可以劑量依賴性的RPE 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

Bcl-2 及Bax 均屬于細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡信號通路中的信號分子。其中，Bcl-2 為抗凋亡蛋白，通過阻止細(xì)胞色素C 的釋放抑制凋亡；Bax 為促凋亡蛋白，通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放促進(jìn)凋亡[11]。Western blot 結(jié)果顯示，H2O2抑制RPE 細(xì)胞中抗信號分子Bcl-2 的表達(dá)，促進(jìn)凋亡信號分子Bax 的表達(dá)，經(jīng)過藏紅花素處理后，Bcl-2 的表達(dá)升高，Bax 的表達(dá)下降，進(jìn)一步說明藏紅花素能夠有效抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡。

總之，本研究初步證實藏紅花素對氧化應(yīng)激環(huán)境下RPE 細(xì)胞的保護作用，為今后預(yù)防和治療視網(wǎng)膜退行性疾病提供了一定方向。