冷凍干燥法制備殼聚糖微膠囊

李思敏，彭 茜，戴志遠(yuǎn)，2，葉 繁

(1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

金槍魚魚油中含有較高的DHA和EPA，具有很高的營養(yǎng)價值。ω-3不飽和脂肪酸具有預(yù)防心血管疾病、增強免疫力、健腦益智、保護(hù)視網(wǎng)膜等一系列功效[1-2]。由于魚油不溶于水，且對光、熱、氧極為敏感，大大限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。殼聚糖是一種天然聚陽離子堿性多糖[4]，有良好的生物相容性、可降解性和成膜性[3]，加之殼聚糖不易溶于水而易溶于酸的溶解特性，使其具有靶向和緩釋的優(yōu)點，成為制備微膠囊的理想壁材[4-8]。但是，以殼聚糖為單一壁材，通過單凝聚法制得的殼聚糖微膠囊包埋率不理想，從而導(dǎo)致微膠囊貯藏時間不長。目前，對以殼聚糖為單一壁材制備工藝的研究較少，大多數(shù)的研究[9-13]采用殼聚糖與其他材料的復(fù)配作為壁材，來改善殼聚糖的性能，提高包埋率，延長貯藏時間。本文通過優(yōu)化制備工藝條件，初步改善殼聚糖單凝聚法制得的微膠囊包埋率。

油脂微膠囊化是利用一定技術(shù)把油脂封閉包裹在微米級的球狀微膠囊中[14]。微膠囊產(chǎn)品可以有效防止油脂氧化，便于運輸和計量使用，油脂微膠囊化更適合工業(yè)化生產(chǎn)[15-21]。冷凍干燥是將待干燥樣品快速凍結(jié)后，在高真空條件下升華去除結(jié)成冰的水分的干燥方法[23]。凍干過程保持低溫凍結(jié)狀態(tài)，可有效降低溫度及氧氣等不良條件對光、熱、氧敏感的魚油為代表的芯材的影響[22-25]。選擇殼聚糖為壁材，通過冷凍干燥技術(shù)制備金槍魚油微膠囊，并對魚油微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，為殼聚糖的應(yīng)用和深海魚加工副產(chǎn)物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

自制乙酯化金槍魚油(粗魚油購自舟山奧旭魚油制品有限公司)；脂肪酸乙酯混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(純品，上海安譜實驗科技股份有限公司)；自制低分子量殼聚糖(重均分子量約250 kDa，脫乙酰度為90%，殼聚糖購自國藥試劑公司)；冰乙酸、石油醚、乙醚、乙醇、Tween80、Span80等試劑均為分析純。ALPHA 1-4 LSC實驗室凍干機(德國CHRIST公司)；7890A 氣相色譜儀(美國Agilent 公司)；Trace GC Ultra 氣相色譜與DSQ Ⅱ質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)涂層萃取頭(美國Supelco公司)；落地式高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；超純水系統(tǒng)(法國Milli-Q公司)； LRH-150-S 恒溫恒濕培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。其他為實驗室常用儀器和設(shè)備。

1.2 方法

1)魚油理化指標(biāo)測定。分別參照國標(biāo)[26-29]方法測定自制魚油的酸價、過氧化值、碘值及不皂化物。

2)魚油微膠囊制備及優(yōu)化。魚油微膠囊制備方法如下：將殼聚糖溶于1%乙酸溶液配置成殼聚糖溶液，向其中加入適量魚油和乳化劑Tween80和Span80，13 000 r/min磁力攪拌10 min充分乳化后，35 MPa下高壓均質(zhì)10 min，置于-40℃冰箱中預(yù)凍后冷凍干燥得魚油微膠囊。乳化劑復(fù)配梯度設(shè)計為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，以乳化液穩(wěn)定性為指標(biāo)，確定乳化劑復(fù)配比例。在此基礎(chǔ)上，分別考察壁材質(zhì)量濃度、壁芯比(體積濃度)、乳化劑添加量(質(zhì)量濃度)對微膠囊包埋率及包載效率的影響；壁材質(zhì)量濃度梯度設(shè)計為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%；壁芯比梯度設(shè)計為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3；乳化劑添加量梯度設(shè)計為0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%。在單因素試驗得出較優(yōu)方法的基礎(chǔ)上，以壁材質(zhì)量濃度、壁芯比和乳化劑添加量三個因素為自變量，以包埋率為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，得出最優(yōu)方法。

3)魚油微膠囊理化指標(biāo)測定。魚油微膠囊的水分含量、表面油含量、油脂過氧化值的測量參照SC/T 3505—2006《魚油微膠囊》中的方法。魚油微膠囊總油含量、包埋率、堆積密度及體積密度的測量參照王藝穎[30-31]的方法。乳狀液穩(wěn)定指數(shù)參照王藝穎[31]及王倩[37]的方法進(jìn)行修改：先將乳狀液稀釋至1/10，再置于 100 毫升具塞量筒中，于25℃下靜置 24 h，記錄上清液體積，根據(jù)下式計算穩(wěn)定指數(shù)(SSI)：

SSI=(V0-V1)/V0×100%

(1)

式中：V0為乳狀液總體積，mL；V1為上清液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin軟件分析及作圖，利用Design-Expert.8.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚油基本理化性質(zhì)

經(jīng)實驗測得，魚油水分含量(0.19±0.03)%,、過氧化值(4.08±0.05) mmol/kg、酸價(2.01±0.12) mg/g、碘值(148.32±0.20) g/100 g、皂化值KOH(278.05±0.18)mg /g、不皂化物(1.01±0.03)%以及DHA+EPA相對含量(60.64±0.05)%。自制乙酯化金槍魚油呈橘紅色，顏色清亮。根據(jù)魚油行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3503-2016，實驗室自制乙酯化魚油符合二級精制魚油的各項指標(biāo)。

2.2 魚油微膠囊單因素試驗結(jié)果

2.2.1 壁材質(zhì)量濃度的選擇

殼聚糖幾乎不溶于水，可以溶于稀酸，預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)5%的殼聚糖溶液難以配置，可能是由于殼聚糖的分子量較大導(dǎo)致溶解性較差，高質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液不易配制，故設(shè)置濃度梯度分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，不同殼聚糖濃度對微膠囊包埋率及包載率的影響如圖1所示。壁材質(zhì)量濃度對包埋率及包載率影響顯著，均在2.0%左右達(dá)到最大值，這與王藝穎等[31]、胡莉等[32]的研究結(jié)果類似。有研究證明，壁材質(zhì)量濃度越高，乳液液滴越密集，乳液黏度越大[30-33]，分散性越差。殼聚糖-魚油乳液粒徑會隨壁材質(zhì)量濃度增加而增大[31]，粒徑過大則難以均質(zhì)，進(jìn)而影響凍干效果和效率，從而導(dǎo)致包埋率和有效載量降低。

圖1 壁材質(zhì)量濃度對包埋率和包載率的影響

2.2.2 壁芯比的選擇

壁芯比是影響微膠囊形成的重要因素。圖2表明，壁芯比為3∶1、2∶1、1∶1時包埋率差別不大，在68%左右，隨著油相比例加大，乳化劑對水油的乳化作用下降，溶液乳化不充分，使得包埋率顯著下降，而包載率在壁芯比2∶1時達(dá)到最高值。一般認(rèn)為，壁材比例越高，壁材包覆芯材的概率更大，包埋率更高[35]。但壁材比例加大也意味著壁材質(zhì)量濃度更高，乳液體系黏度越高，造成微膠囊粘連成團(tuán)，降低乳狀液穩(wěn)定性。高宇杰等[36]指出芯材比例的提高會使微膠囊壁厚度下降、囊壁通透性增加，導(dǎo)致油脂泄露和外壁附著，影響乳液分散狀態(tài)。

圖2 壁芯比對包埋率和包載率的影響

2.2.3 乳化劑添加量的選擇

制備的乳狀液屬于水包油型，需要的親水性乳化劑用量多于親油性乳化劑。應(yīng)用兩種或兩種以上的油溶性和水溶性乳化劑協(xié)同應(yīng)用，可獲得排列較緊密、相互作用強烈、機械強度較高的界面膜，提高乳狀液穩(wěn)定性，因此選用乳化效果好且成本低、適宜生產(chǎn)實踐使用的Tween80和Span80復(fù)配使用。由圖3可知，Tween80和Span80比例為2∶1添加時，乳液穩(wěn)定性最佳，因此選擇乳化劑復(fù)配比為Tween80∶Span80=2∶1。

乳化劑能降低物質(zhì)表面張力，改善兩相分散效果，是微膠囊制備中的關(guān)鍵因素。由圖4可見，包埋率在乳化劑添加量為0.75%時達(dá)到最大，而包載率在添加量為1.25%時相對更高。乳化劑添加量不是越多越好，在一定范圍內(nèi)，添加乳化劑有助于降低微膠囊粒徑，維持水油兩相平衡，提高乳狀液穩(wěn)定性[24]。壁材和芯材形成穩(wěn)定乳狀液所需表面活性劑的數(shù)量是一定的，當(dāng)超過這個量時，乳化劑作用效果不明顯[31]，甚至影響包埋穩(wěn)定性。有研究表明，乳化劑用量過高會造成芯材分散度過小，表面積增大，無法被有效包埋[24]。

圖3 乳化劑復(fù)配比對乳化液穩(wěn)定性的影響

圖4 乳化劑添加量對包埋率和包載率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化微膠囊制備過程

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在乳化劑Tween80和Span80質(zhì)量濃度比為2∶1條件下，得到較優(yōu)制備參數(shù)為：壁材質(zhì)量濃度2.0%，壁芯比2∶1，乳化劑添加量1.00%，在此基礎(chǔ)上設(shè)計三因素三水平的正交試驗，因素水平編碼見表1。選取壁材質(zhì)量濃度(A)、壁芯比(B)和乳化劑添加量(C)三個因素為自變量，以魚油微膠囊包埋率(Y)為目標(biāo)函數(shù)，做三因素三水平共 17個試驗點，包括 5個中心點和12個析因點，實驗設(shè)計和結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面法的因素水平編碼

表2 正交試驗直觀分析表

對表2進(jìn)行回歸分析得到相應(yīng)的二次響應(yīng)面回歸方程：

Y=79.20+0.30A-1.71B+1.06C-1.01AB+0.93AC+0.22BC-4.46A2-5.25B2-0.94C2

表3 回歸模型及方差分析結(jié)果

注：** 為差異極顯著(P<0.01)；* 為差異顯著(P<0.05)

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化及驗證實驗結(jié)果

圖5直觀地反映了壁材濃度、壁芯比、乳化劑添加量這三個因素間的交互作用及對包封率的影響。圖中可以看出，包埋率的較高點均在所選因素范圍的中間區(qū)域，因素B(壁芯比)的響應(yīng)面曲線較另外兩個因素坡度更大，說明對包埋率影響更顯著，這與回歸方程的結(jié)果相同。采用Design-Export 8.0.6軟件，以得到最高包埋率為目標(biāo)進(jìn)行分析，得到魚油微膠囊的最佳制備條件為：壁材質(zhì)量濃度2.12%，壁芯比1.84∶1，乳化劑添加量0.90%，在此條件下，魚油微膠囊包埋率理論值為79.67%。為驗證響應(yīng)面模型的有效性，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行3次平行實驗，包埋率依次為79.51%、79.57%、79.53%，平均包埋率79.54%，與理論值接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。為驗證響應(yīng)面模型的有效性，進(jìn)一步擴大試驗用于生產(chǎn)，提高實用性，根據(jù)響應(yīng)面模型結(jié)果，略微擴大制備條件范圍進(jìn)行驗證實驗。每組實驗結(jié)果取三次平行實驗的平均值，得到結(jié)果：當(dāng)壁材質(zhì)量濃度2.1%、壁芯比1.8∶1、乳化劑添加量0.9%時，平均包埋率79.40%；壁材質(zhì)量濃度2.1%、壁芯比1.9∶1、乳化劑添加量0.9%時，平均包埋率79.45%；壁材濃度2.2%，壁芯比1.8∶1，乳化劑添加量0.9%時，平均包埋率79.26%；壁材質(zhì)量濃度2.2%，壁芯比1.9∶1，乳化劑添加量0.9%時，平均包埋率79.19%。由此可知，魚油微膠囊的制備條件為：壁材質(zhì)量濃度2.1%，壁芯比1.9∶1，乳化劑添加量0.9%，在此條件下魚油微膠囊包埋率均能得到較高的包埋率。

圖5 各因子交互作用對包埋率的響應(yīng)曲面圖(質(zhì)量濃度)

2.4 魚油微膠囊的理化性質(zhì)

以最優(yōu)方法制備的魚油微膠囊水分含量(1.07±0.02)%、過氧化值(4.72±0.04)mmol/kg、堆積密度(0.55±0.03)kg/m3、體積密度(0.54±0.03)kg/m3及包埋率(79.45±0.03)%，均符合水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3505—2006中的要求。魚油微膠囊整體呈淺黃色，無明顯腥味，凍干成型時整體呈疏松塊狀，研磨成粉基本不影響微膠囊理化性質(zhì)。魚油微膠囊中的DHA+EPA相對含量仍有(57.24±0.05)%，說明微膠囊制備過程對魚油關(guān)鍵不飽和脂肪酸DHA和EPA的損耗不大，為進(jìn)一步研究微膠囊對魚油的保護(hù)作用提供了良好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以殼聚糖為壁材，以冷凍干燥法對金槍魚油進(jìn)行包埋制備魚油微膠囊。以魚油微膠囊的包埋率和包載率為評價指標(biāo)，對微膠囊制備工藝進(jìn)行單因素試驗得到較優(yōu)制備工藝；又進(jìn)一步以包埋率為關(guān)鍵指標(biāo)，對工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，結(jié)合實際生產(chǎn)情況，得到最優(yōu)工藝：在乳化劑Tween80和Span80比為2∶1的條件下，壁材濃度2.1%，壁芯比1.9∶1，乳化劑添加量0.9%，在此條件下魚油微膠囊實際平均包埋率為79.45%。魚油微膠囊呈淺黃色粉末，魚腥味極輕，理化性質(zhì)符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，制備過程對魚油DHA和EPA的含量影響不大。

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