銀杏葉提取物對慢性阻塞性肺疾病大鼠血清及肺組織中CRP、IL-1及IL-8的影響

王明娟，齊永奇

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.華北水利水電大學(xué)，河南 鄭州 450045)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全可逆性氣流受限為主要特征，累及氣道、肺實質(zhì)及肺血管的一種常見慢性疾病[1]，目前其發(fā)病機(jī)制和致病機(jī)理尚不完全明確。普遍認(rèn)為COPD是由個體疾病易獲得因素和外界因素共同造成的，隨著吸煙人數(shù)的增多和空氣污染的加劇，該病癥發(fā)病率和病死率日趨上升，對社會經(jīng)濟(jì)造成巨大壓力，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[2]。COPD的病情發(fā)展比較迅速，可逐漸發(fā)展為肺心病、心力衰竭、呼吸衰竭等，救治不及時甚或危及生命。當(dāng)前研究成果認(rèn)為,COPD的發(fā)生涉及炎性反應(yīng)、氧化損傷、蛋白酶-抗蛋白酶失調(diào)、免疫功能障礙等多個方面[3]。銀杏是中醫(yī)傳統(tǒng)藥物，具有悠久的使用歷史，《本草綱目》中記載其有“定喘止咳”之功效。銀杏葉提取物(GinkgobilobaExtract，GBE)是從銀杏的干燥葉中提取的有效藥用組分，主要包括黃酮類、萜類內(nèi)酯、有機(jī)酸、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分。研究證實，GBE能抑制肺氣腫的形成及肺血管重塑，不僅可以增強(qiáng)正常機(jī)體的免疫功能，還可調(diào)節(jié)異常機(jī)體的免疫功能[4]。本次研究就GBE對COPD大鼠道炎癥的病理學(xué)改變及血清及肺組織中CRP、IL-1、IL-8的影響展開觀察，探討其對COPD大鼠氣道和全身炎癥的干預(yù)作用，為臨床治療提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MasterScreen PFT System肺功能儀(德國耶格公司)；自制有機(jī)玻璃熏煙箱(80 cm×40 cm×50 cm)；新津事豐一次性無菌注射器(成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司)；PL2000PLUS血氣生化分析儀(北京普朗醫(yī)療)；BL-420S生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；HX200呼吸流量換能器(上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)儀器發(fā)展有限公司)；CUT6062石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司)。

1.2 藥品與試劑

舒血寧注射液(山西太原藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字:Z14021962，每支5 mL，折合GBE為175 mg，含總黃酮醇苷42 mg、銀杏內(nèi)酯70 mg)；“紅雙喜”牌香煙(上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司)；脂多糖(Sigma-L2880，美國Sigma公司)；注射用乳糖酸紅霉素(廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司，國藥準(zhǔn)字:H45021339)；CRP、IL-1、IL-8 檢測試劑盒(美國R&D公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組方法

健康清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量(210±20)g，由省動物實驗中心提供。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，由專人負(fù)責(zé)管理。實驗室定期消毒，環(huán)境溫度20 ℃～25 ℃，相對濕度50%～70%。飼養(yǎng)1周后開始實驗。所有大鼠稱重后隨機(jī)分為A、B、C、D共4組，每組各15只。A組15只大鼠為正常對照組，B、C、D組共45只大鼠通過香煙熏吸加氣道內(nèi)注入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)方法建立大鼠COPD模型，B組為COPD對照組，C組為GBE干預(yù)組，D組為紅霉素干預(yù)組。

1.3.2 COPD模型建立方法

所有COPD大鼠模型均由香煙熏吸聯(lián)合氣道內(nèi)注入脂多糖的方法進(jìn)行造模[5]。香煙熏吸：上午在自制有機(jī)玻璃熏煙箱內(nèi)給予4根香煙熏吸，每次時間為30 min，結(jié)束后將大鼠轉(zhuǎn)移至實驗室正常環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。脂多糖氣管注入：于實驗第1天和第14天使用10%水合氯醛，按照100 g/0.25 mL的劑量腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定于固定板上，暴露聲門，靜脈套管針插入氣道，快速注入100 μL LPS(1 mg/mL)，直立固定板并旋轉(zhuǎn)，盡可能的使LPS充分均勻的分布于大鼠兩肺。造模共28 d，A 組于第 1 天和第 14 天氣管內(nèi)注入2 mL/kg生理鹽水，B、C、D組除第1天和第14天LPS氣管注入外，其余時間均進(jìn)行香煙熏吸。28 d后對大鼠肺功能進(jìn)行檢測：分別將三通管和呼吸流量換能器連接在Y型氣管插管的兩端，首先記錄一段平靜呼吸曲線，然后在呼吸末使用注射器在三通管段內(nèi)快速注入6 mL空氣，立即脫開后自然呼出，使用BL-420S生物機(jī)能實驗系統(tǒng)記錄呼吸曲線并計算0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)及大鼠FEV0.3占用力肺活量百分比(FEV0.3/FVC)。B、C、D組各取兩只大鼠處死，迅速取出完成肺組織，生理鹽水沖洗干凈后將肺部組織放入10%的福爾馬林液中固定24 h后,乙醇及正丁醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。使用光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織改變，若出現(xiàn)肺泡壁變薄、斷裂，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，支氣管黏膜變性、壞死，伴有炎性細(xì)胞浸潤，或肺氣腫病理改變等符合COPD表現(xiàn)，結(jié)合肺功能下降即可說明COPD造模成功。

1.3.3 給藥方法

所有大鼠均為腹腔注射給藥，A、B組給予生理鹽水0.4mL/(kg·d)，C組給予GBE 0.4 mL/(kg·d)，D組根據(jù)體表面積換算方法為100 mg/kg2給予紅霉素。所有療程均為2周。

1.3.4 肺泡灌洗方法

使用10%水合氯醛將大鼠麻醉，器官插管，四肢固定于固定板，打開胸腔，充分暴露肺部，結(jié)扎左側(cè)肺門。分離大鼠頸部氣管，并在氣管下端橫切一小切口，緩慢插入氣管插管。若有輕微阻滯的感覺則表明氣管插管達(dá)到隆突部位，需要略微旋轉(zhuǎn)退回一部分插管，結(jié)扎完成插管。將事先備好的5 mL注射器吸取2 mL生理鹽水緩慢注入大鼠右肺進(jìn)行灌洗，在適宜的時機(jī)緩慢抽回灌洗液，再將抽回的灌洗液緩慢注入，重復(fù)3次直到帶有泡沫的微混液體流出表示1次灌洗成功。

1.4 觀察指標(biāo)

1)血清CRP、IL-1、IL-8：治療完成后抽取動脈血1 mL，靜置30 min后離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測CRP、IL-1、IL-8含量，所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒操作流程。2)肺組織CRP、IL-1、IL-8：治療完成后按照上述肺泡灌洗方法灌洗大鼠肺部，重復(fù)灌洗3次，每次回收灌洗液1.5 mL，共回收所需的4.5 mL肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)置于離心管，震蕩5 min，靜置12 h后離心分離取上相液后待檢，采用ELISA檢測CRP、IL-1、IL-8含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清和肺組織CRP水平比較

B、C、D組血清和肺組織CRP水平均明顯高于A組(P<0.05)；C、D組血清和肺組織CRP水平相較B組有明顯降低(P<0.05)，其中C、D組兩組相較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 血清和肺組織IL-1水平比較

B、C、D組血清和肺組織IL-1水平均明顯高于A組(P<0.05)；C、D組血清和肺組織IL-1水平相較B組有明顯降低(P<0.05)，其中C、D組兩組相較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

組別例數(shù)血清BALFA組131.10±0.32b1.98±0.21bB組132.97±0.48a2.99±0.27aC組131.47±0.35abc2.27±0.24abcD組131.56±0.46ab2.31±0.21abF52.57743.502P<0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與D組比較，cP>0.05。

組別例數(shù)血清BALFA組1364.52±25.31b38.91±15.28bB組13118.73±50.62a74.65±30.31aC組1368.53±28.75abc39.51±16.37abcD組1371.62±27.46abc41.25±18.20abcF7.0248.998P0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與D組比較，cP>0.05。

2.3 血清和肺組織IL-8水平比較

B、C、D組血清和肺組織IL-8水平均明顯高于A組(P<0.05)；C、D組血清和肺組織IL-8水平相較B組有明顯降低(P<0.05)，其中C、D組兩組相較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

組別例數(shù)血清BALFA組1375.60±12.35b41.28±8.93bB組13173.62±35.82a65.78±15.67aC組1383.61±15.26abc43.35±9.35abcD組1382.37±16.03abc44.61±10.31abcF58.84813.096P<0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與D組比較，cP>0.05。

3 討論

COPD是臨床常見疾病，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高“三高”的特點，其主要表現(xiàn)為氣流受限、肺功能下降，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，同時也帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。隨著環(huán)境的不斷惡化和吸煙人群的不斷上升，COPD的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。積極探索COPD病理和發(fā)病機(jī)制，研究有效的輔助治療藥物提高該病的臨床治療效果和預(yù)后十分必要。COPD是一種可預(yù)防和治療的疾病，但目前未證實有藥物能夠顯著改善患者肺功能長期下降的趨勢，對于COPD急性發(fā)作的患者，其治療目標(biāo)是盡可能的降低急性發(fā)作對患者造成的影響并預(yù)防再次急性發(fā)作。研究證實，COPD的發(fā)病機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及細(xì)胞凋亡等多個方面[6]。炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子在COPD的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，故而抑制炎癥反應(yīng)是COPD治療中的重要環(huán)節(jié)。COPD患者體內(nèi)血液處于高凝狀態(tài)，長期血液高凝狀態(tài)極易形成微血栓，加速COPD的進(jìn)展。因此在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上配合抗凝、抗感染等綜合治療措施具有非常明顯的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GBE對改善血液高凝狀態(tài)、降低肺動脈壓及肺血管阻力具有明顯的作用[7]，但其在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究不多見，故而本次實驗通過觀察GBE對COPD大鼠血清和肺組織炎性介質(zhì)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為COPD的治療和預(yù)防提供實驗依據(jù)。

吸煙、環(huán)境暴露和有機(jī)粉塵是COPD的主要致病因素[8]。鑒于此，本次研究采用香煙熏吸聯(lián)合氣道內(nèi)注入脂多糖的方法造模。結(jié)果顯示該方法可導(dǎo)致與COPD 相同的病理生理學(xué)改變。COPD患者氣道管腔及管壁內(nèi)存在大量的炎癥細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)其水平與COPD癥狀嚴(yán)重程度呈一定的正相關(guān)性[9]。CRP是臨床上最常用的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物之一，其具有激活補(bǔ)體，促進(jìn)炎癥吸收等功能[10]，對COPD慢性炎癥的敏感度很高。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)、組織損傷、惡性腫瘤時，CRP水平顯著升高，其血清濃度上升速度與炎癥反應(yīng)的范圍及程度具有正相關(guān)性。血清CRP水平可以反應(yīng)COPD患者氣道炎癥程度，持續(xù)高水平的CRP會及你不造成氣道上皮功能的損傷，影響患者肺功能。IL-1一般存在于血液和組織中，主要有單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，分為IL-1α和IL-1β兩型。IL-8也由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促使中性細(xì)胞?；罨?、遷移、釋放炎性介質(zhì)，直接對組織產(chǎn)生損害。因IL-11β能夠激發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)NF-кB信號通路，誘導(dǎo)IL-8的釋放[11]，可將IL-1β和IL-8納入同一反應(yīng)鏈中。IL-1和IL-8在COPD病情的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本次研究顯示，B組(COPD對照組)大鼠血清和肺組織中CRP、IL-1、IL-8均明顯高于A組(正常對照組)，與其他學(xué)者研究結(jié)果基本一致[12]。紅霉素能夠減輕COPD患者氣道炎癥反應(yīng)已成為普遍認(rèn)識，因此本次研究以紅霉素作為干預(yù)對照組與GBE組的干預(yù)效果形成對照。本次研究結(jié)果顯示，C組(GBE干預(yù)組)和D組(紅霉素干預(yù)組)大鼠血清和肺組織中CRP、IL-1、IL-8均比B組有明顯的降低(P<0.05)，且C組和D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明GBE與紅霉素干預(yù)效果相當(dāng)，能夠有效抑制COPD氣道及全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證明了GBE對COPD的輔助治療作用。

GBE主要由黃酮類、萜類內(nèi)酯化合物等組成，其中銀杏內(nèi)脂是其中最重要的成分。血小板活化因子會導(dǎo)致炎癥細(xì)胞向氣道遷移、活化并釋放炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，同時釋放的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子又能夠增加血小板活化因子的合成[12]。因此抑制血小板活化因子的合成是治療的重要部分。銀杏內(nèi)脂具有選擇性抗拮抗血小板活化因子的功能，作為血小板活化因子受體抗結(jié)劑，GBE可以直接對氣道炎癥細(xì)胞的聚集、活化進(jìn)行抑制[13]，從而降低炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，降低氣道炎癥反應(yīng)[14-15]。與此同時，炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放的有效抑制也降低血小板活化因子的合成，進(jìn)一步提高GBE的抗炎效果。

隨著國內(nèi)外對GBE的化學(xué)成分及作用機(jī)制的研究不斷深入，對其藥用價值有了更深的了解和重視。GBE的成分決定具有多靶點綜合治療作用，副作用小，應(yīng)用前景廣泛[16]。但是GBE主要成分的藥動力學(xué)特征受到物質(zhì)本身理化性質(zhì)及機(jī)體胃腸道環(huán)境的限制，口服GBE生理不用率不高[17]。在人體內(nèi)GBE藥動力學(xué)研究，尤其是對吸收、分布、代謝等環(huán)節(jié)更加細(xì)致的研究尚顯薄弱。加上這方面的研究對GBE藥理作用的實質(zhì)能夠有更加深入的了解，以便于指導(dǎo)臨床合理用藥、試劑改革、新藥研究。

綜上所述，GBE能夠抑制COPD大鼠氣道和全身炎癥反應(yīng)，可能是通過降低血清及肺組織中CRP、IL-1、IL-8水平來實現(xiàn)。GBE具有抗變態(tài)反應(yīng)、減輕氣道炎癥、提高機(jī)體免疫力等綜合治療作用，能夠廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防呼吸系統(tǒng)疾病。