電針委中穴對(duì)腰椎退變大鼠腰椎間盤(pán)中NFAT5表達(dá)的影響

朱杭 陶其杰 林士明 唐成坤 潘浩

隨著人們勞動(dòng)方式和生活方式的改變,椎間盤(pán)退變的發(fā)病率逐年上升,呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1].據(jù)統(tǒng)計(jì)由腰椎間盤(pán)退變引起的腰痛患者占門(mén)診的60%~80%,其中約11%~12%的患者生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[2-3],防治腰痛、延緩椎間盤(pán)退變逐年受到重視.近年來(lái),有學(xué)者發(fā)現(xiàn)滲透壓與椎間盤(pán)退變過(guò)程有緊密聯(lián)系,維持滲透壓平衡在緩解椎間盤(pán)退變中維持著重要作用.目前已知電針在防治腰椎間盤(pán)退變引起的腰痛中有較好療效,對(duì)其延緩?fù)俗兒途徑馓弁吹臋C(jī)制也有一定了解[4-7].故本研究通過(guò)制作去雙前肢誘導(dǎo)直立大鼠模型,模擬人椎間盤(pán)的自然退變過(guò)程,觀察電針委中穴對(duì)模型大鼠腰椎間盤(pán)組織中滲透壓核轉(zhuǎn)錄因子5(NFAT5)表達(dá)變化,探討委中穴在防治腰椎間盤(pán)退行性變的可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 選用正常離乳SD大鼠(3周齡)32只,雌雄不限,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.在標(biāo)準(zhǔn)條件下常規(guī)飼養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、電針委中穴組、電針?lè)茄ńM,每組各8只.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)試劑 選用低溫離心機(jī)、金屬恒溫箱、正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康);石蠟包埋機(jī)、病理切片機(jī)、烤片機(jī)(武漢俊杰);酶標(biāo)儀(美國(guó) TEK-BIO 儀器廠);普通PCR儀(ABI 公司)、華佗牌G6805電針儀(蘇州產(chǎn)); Trizol裂解緩沖液(北京鼎國(guó));甲酰胺(Sigma 公司),溴乙錠(Sigma 公司),焦碳酸二乙酯(DEPC,Sigma 公司);OligoDNA引物合成(委托北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成);阿利新藍(lán)染色液(武漢谷歌生物)等.

1.3 去雙前肢誘導(dǎo)直立大鼠模型的建立 參照Liang'等[8]的方法制作去雙前肢誘導(dǎo)直立大鼠模型(以下簡(jiǎn)稱(chēng)雙足鼠).除空白組外余下24只大鼠按35mg/kg給予3%濃度戊巴比妥鈉,進(jìn)行麻醉后,隨后予以腋下備皮、碘伏消毒,取上臂中上1/3 處橫向切開(kāi)皮膚,逐層剝離,暴露三角肌下血管神經(jīng)束,予以絲線結(jié)扎,再用組織剪剪斷肌肉、血管和神經(jīng),用咬骨鉗咬斷肱骨,碘伏擦拭后逐層縫合.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在(37±0.5)℃的溫度下進(jìn)行,術(shù)后4-0絲線逐層縫合.并給予抗炎藥物肌肉注射.術(shù)后置于特制飼養(yǎng)籠內(nèi),食物及飲水裝置放于鼠直立位可觸及高度,同期選取大小合適的特制塑料管,將雙足鼠放置于管中使其被迫站立,10h/d.

1.4 各組處理方法 到達(dá)造模周期后隨機(jī)抽取雙足鼠與空白組大鼠各一只,分別處死取腰椎間盤(pán)組織行阿爾新藍(lán)染色,確認(rèn)造模是否成功.造模成功后模型組、電針委中穴組、電針?lè)茄ńM共21只造模大鼠,每組各7只.空白組:飼養(yǎng)在特制鼠籠,無(wú)特殊處理;模型組:建立雙足鼠模型,不予電針處理.電針組:于造模成功后第1天開(kāi)始行電針治療30min/(次.d),連續(xù)治療15d.治療方法:定位參照李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9],取大鼠雙側(cè)委中穴,予以剪毛,助手拉直大鼠的膝關(guān)節(jié),運(yùn)用雙極聯(lián)體針[10]直刺0.3cm,快速提插捻轉(zhuǎn)至針下有沉澀感后,接通SDZ-II型華佗牌電針治療儀,參數(shù)為疏密波,2Hz/15Hz,刺激強(qiáng)度為1~2mA,針刺強(qiáng)度以部位輕微抖動(dòng)為宜,30min/(次.d),連續(xù)治療15d;非穴組的對(duì)照點(diǎn)設(shè)在委中穴內(nèi)側(cè)旁開(kāi)0.3cm,余治療同委中穴組.

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 治療周期結(jié)束后,根據(jù)大鼠體重按35mg/kg給予3%濃度戊巴比妥鈉予以麻醉,取出L1-L5脊椎置于冰上進(jìn)行操作,快速取出對(duì)應(yīng)椎間盤(pán),經(jīng)PBS沖洗后,放置在預(yù)冷的4℃4%多聚甲醛中,固定24h.NFAT5及有機(jī)滲透轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)檢測(cè):從GenBank獲取目的基因mRNA的全長(zhǎng)序列,利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列.經(jīng)Blast分析,引物序列都具有特異性.所用的引物及內(nèi)參照β-actin引物(引物均委托北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)所示:

目的基因 引物序列NFAT5 5'-CGACAGTGCCAAAGCACCTC-3'5'-AACCGGATACTGTCCACACAACAT-3'BGT 1 5'-GACAAGGACCAGGTGAAGGAT -3'5'-AGGCAAGGATGATGATFTAGTAGA-3'TauT 5'-GCGGTGATAACTTATATGACGGTAT-3'5'-GGCAGAGGAGGATGACAATGA-3'AR 5'-TTTCCTTCTTTCTTTTTCTTCTTCT-3'5'-GGTTTTTTTACTCTCTCTGTTTGTT-3'β-actin 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'

取腰椎間盤(pán)組織,采用Trizol法提取總RNA,完成后定量.實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)條件:95℃、30s,95℃、30s,60℃、34s,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán).以β-actin作為內(nèi)參照.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ABI 7500軟件進(jìn)行分析.其相對(duì)定量值使用比較Ct法進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算公式為.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件.計(jì)量資料以(±s)表示,組間比較若滿(mǎn)足正態(tài)性且方差齊時(shí)采用單因素方差分析LSD法和SNK法,方差不齊時(shí)選擇Tamhane T2和DunnettT3法進(jìn)行方差檢驗(yàn)和兩兩比較,若不滿(mǎn)足正態(tài)性時(shí)采用秩和檢驗(yàn).P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 椎間盤(pán)組織病理學(xué)變化 術(shù)后4個(gè)月,分別隨機(jī)選取1只雙足鼠和1只正常組大鼠,予以腹腔麻醉后取腰椎間盤(pán)行阿爾新藍(lán)染色能與蛋白多糖結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色,骨組織不著色.正常組(見(jiàn)圖1A),鏡下可見(jiàn)椎間盤(pán)中央完整的髓核和纖維環(huán)結(jié)構(gòu)清晰、層次分明,與髓核界線清楚,髓核內(nèi)有豐富的空泡細(xì)胞和小的類(lèi)軟骨樣細(xì)胞,髓核內(nèi)細(xì)胞聚集在其中,整體髓核組織染色較深.模型組(見(jiàn)圖1B):椎間盤(pán)纖維環(huán)排列紊亂甚至斷裂,髓核縮小,髓核內(nèi)網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)消失,髓核和纖維環(huán)界線不清,整體椎間盤(pán)組織染色較淡.提示本次造模成功.

圖1 大鼠腰椎間盤(pán)組織結(jié)構(gòu)觀察

2.2 各組大鼠椎間盤(pán)組織中NFAT5、TauT、AR及BGT1 mRNA表達(dá)情況 Real-Time PCR結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組椎間盤(pán)內(nèi)NFAT5、BGT1、AR及TauT mRNA表達(dá)含量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且 NFAT5及 BGT1、TauT、AR mRNA呈現(xiàn)正向關(guān)系;與模型組比較,電針組NFAT5 mRNA表達(dá)含量均有上升,其中電針委中穴組升高更為明顯(P<0.05),電針?lè)茄ńM雖有表達(dá),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);NFAT5及 BGT1、TauT、AR mRNA在電針委中穴與電針?lè)茄ńM中均有表達(dá),但前者較后者顯著(P<0.05)(見(jiàn)表1、2).

表1 椎間盤(pán)退變后各組大鼠NFAT5 mRNA的表達(dá)情況(±s)

表1 椎間盤(pán)退變后各組大鼠NFAT5 mRNA的表達(dá)情況(±s)

注:與正常組比較,*P<0.01,#P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與電針委中穴比較,◇P<0.05

組別 數(shù)量(只) NFAT5含量正常組 7 1.29±0.207模型組 7 0.78±0.185*電針委中穴組 7 1.06±0.164#△電針?lè)茄ńM 7 0.85±0.193*◇

表2 各組大鼠椎間盤(pán)內(nèi)BGT1、TauT、AR mRNA的表達(dá)情況(±s)

表2 各組大鼠椎間盤(pán)內(nèi)BGT1、TauT、AR mRNA的表達(dá)情況(±s)

注:與正常組比較,*P<0.01,#P<0.05;與模型組比較,▲P<0.01,△P<0.05;與電針委中穴比較,◇P<0.05

組別 數(shù)量(只) BGT1 mRNA TauT mRNA AR mRNA正常組 7 1.04±0.099 0.99±0.246 1.13±0.132模型組 7 0.67±0.140* 0.44±0.173* 0.48±0.158*電針委中穴組 7 0.86±0.198#△ 0.72±0.202#△ 0.66±0.122*▲電針?lè)茄ńM 7 0.70±0.059*◇ 0.49±0.130*◇ 0.51±0.143*◇

3 討論

普遍認(rèn)為腰椎間盤(pán)退行性變是直接產(chǎn)生腰痛的主要原因.祖國(guó)醫(yī)學(xué)尚無(wú)"腰椎間盤(pán)退變"的診斷,通過(guò)結(jié)合患者臨床癥狀可以歸為"痹癥"、"腰痛"范疇.委中穴是治療腰椎退變疾病的常用穴位,《乾坤生意》記載:"腰背委中求",是對(duì)其主治作用的經(jīng)典概括.委中穴又名"血郄"、"郄中"等,屬于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的合穴.白亞楠等[11]通過(guò)收集27部古籍中治療腰痛病案并進(jìn)行匯總,發(fā)現(xiàn)委中穴使用頻次最多,達(dá)25次.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn):支配委中穴的傳入神經(jīng)投射到脊髓的節(jié)段與腰背部神經(jīng)節(jié)段的分布在后根神經(jīng)節(jié)與脊髓存在部分重疊,在神經(jīng)解剖學(xué)上得到客觀論證.近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者從炎癥反應(yīng)、局部血流、神經(jīng)再生、疼痛物質(zhì)改變和肌纖維修復(fù)等多方向進(jìn)行相關(guān)研究[4-7],使委中穴防治腰椎間盤(pán)退變疾病的機(jī)制有了深一步的了解.

NFAT5作為Rel蛋白家族之一,有與NFAT家族相似的序列,也是目前唯一已知在哺乳動(dòng)物體內(nèi)由滲透壓激活的轉(zhuǎn)錄因子,通常分布于腎臟、關(guān)節(jié)、晶狀體、椎間盤(pán)等已知的高滲組織中.高滲刺激下,磷酸化的NFAT5進(jìn)入胞核進(jìn)行核易位、活性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及NFAT5合成三步驟,通過(guò)自身調(diào)控使細(xì)胞發(fā)生了一系列適應(yīng)性改變以防止其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害.另外,通過(guò)結(jié)合滲透轉(zhuǎn)運(yùn)體的TonE/ORE序列調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TauT)、醛糖還原酶(aldose reductase,AR)、鈉離子三甲銨乙內(nèi)酯(BGT-1)形成,促進(jìn)有機(jī)滲透物質(zhì)入胞內(nèi),平衡內(nèi)環(huán)境.研究發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞所生長(zhǎng)的環(huán)境是一個(gè)偏向低氧、低PH及高滲的生態(tài)龕.高滲環(huán)境可以促使髓核組織在高載荷作用下維持對(duì)水分子的吸附力,椎間盤(pán)組織通過(guò)利用髓核組織自身生理特點(diǎn)和調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的水合狀態(tài)從而達(dá)到承載日常脊柱壓力,分散載荷.然而隨著人體姿勢(shì)的改變,椎間盤(pán)組織承受體重和肌肉不同因素的聯(lián)合作用,椎間盤(pán)內(nèi)水合狀態(tài)時(shí)刻發(fā)生改變,晝夜?jié)B透壓發(fā)生改變,使得髓核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂,從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害,造成椎間盤(pán)退行性變.本次實(shí)驗(yàn)顯示空白組中的NFAT5表達(dá)含量明顯高于模型組(P<0.05),說(shuō)明NFAT5是正常椎間盤(pán)滲透環(huán)境中髓核細(xì)胞存活和功能所必需的滲透轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)參與基質(zhì)穩(wěn)態(tài)以響應(yīng)滲透壓的改變;AR負(fù)責(zé)催化山梨醇的生成、TauT及BGT1則分別負(fù)責(zé)有機(jī)滲透物質(zhì)牛磺酸和甜菜堿的積聚[12],有機(jī)滲透物可以保護(hù)生物分子免受由滲透壓和脫水改變引起的損害,從而提供細(xì)胞保護(hù)和抗炎作用.實(shí)驗(yàn)中AR及TauT、BGT1mRNA表達(dá)量的顯著升高,提示滲透轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)維持髓核細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡起到一定促進(jìn)作用.椎間盤(pán)退變常伴隨滲透壓的下降,所處的低滲環(huán)境可能影響NFAT5的表達(dá),與本次結(jié)果相符.

本次實(shí)驗(yàn)造模選用的去雙前肢誘導(dǎo)大鼠直立模型是目前國(guó)際上公認(rèn)的造模方法,與空白組比較,模型組椎間盤(pán)纖維環(huán)排列紊亂甚至斷裂,髓核縮小,髓核內(nèi)網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)消失,髓核和纖維環(huán)界線不清,整體椎間盤(pán)組織染色較淡.提示雙足鼠造模雖然耗時(shí)較久,但相較于其他造模法,更符合人類(lèi)脊柱的運(yùn)動(dòng)學(xué)及生物力學(xué)特點(diǎn).實(shí)驗(yàn)中模型組的NFAT5及滲透轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AR、BGT-1、TauT)表達(dá)較電針委中穴組呈下降趨勢(shì)(P<0.01),作者推測(cè)委中穴能夠正向調(diào)節(jié)NFAT5表達(dá),達(dá)到維持椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境平衡.與電針?lè)茄ńM比較,委中穴的NFAT5及AR、BGT-1、TauT含量增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示委中穴組與非穴組兩者之間的存在差異性,可能與經(jīng)穴自身結(jié)構(gòu)特異性相關(guān),也說(shuō)明經(jīng)穴與非經(jīng)穴兩者間在療效特異性上存在一定差異.