扶正中藥逆轉TLR4過表達乳腺癌紫杉醇耐藥的機制

張祥建，張欣欣，馬海廣，胡曉清

（1.溫州市中心醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州325027）

乳腺癌是嚴重危害女性健康的最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升[1]。盡管基于分子分型的乳腺癌的個體化綜合治療提高了乳腺癌的療效，但腫瘤的原發(fā)或繼發(fā)耐藥、遠處轉移仍是治療失敗的最主要原因。目前中藥在乳腺癌的治療中得到了廣泛的應用，包括化療減毒、增強免疫、抑制轉移等[2-4]。也有部分臨床研究顯示中藥與化療的聯(lián)合應用，其除了化療減毒外，還可以逆轉腫瘤耐藥[5-6]。然而，其具體作用機制仍缺乏科學的理論依據，同時，中藥對腫瘤的治療和逆轉耐藥作用是否具有一定的腫瘤組織特異性亦缺乏基礎數(shù)據。因此，本研究從TLR4/NF-κB信號通路的角度，探討扶正中藥抗乳腺癌的機制，及增加化療藥物敏感性的干預靶點，從而為特定的腫瘤表型及靶點進行中西醫(yī)結合的藥物治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：扶正中藥（黃芪30 g、黨參12 g、白術9 g、茯苓12 g、仙靈脾15 g、肉蓯蓉12 g、山萸肉12 g、巴戟天12 g）制成凍干粉，溶于雙蒸水中，經0.2 μm孔徑針式過濾器過濾后使用。DMEM、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS均購自美國Gibco公司；紫杉醇（paclitaxel，PTX）購自美國Medchem Express公司；MTT、DMSO、碘化丙啶（PI）、牛胰島素均購自美國Sigma公司；Annexin V/PI試劑盒購自美國Beckman Coulter公司；β-actin抗體及二抗購自上?？党缮锟萍加邢薰?。

1.1.2 儀器：恒溫CO2細胞培育箱（美國Thermo Forma公司）；低溫高速離心機（日本Kubota公司），Synergy2酶標儀（美國Biotek公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；Odyssey雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)（美國Licor公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：MDA-MB-231、T47D人乳腺癌細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。在含10%胎牛血清、0.01%牛胰島素、100 U/L青霉素和10 mg/mL鏈霉素的MEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDAMB-231細胞，在含10%胎牛血清、0.01%牛胰島素、100 U/L青霉素和10 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)T47D細胞，37 ℃、5% CO2恒溫無菌養(yǎng)育箱中生長，每2 d觀察貼壁情況并換液。待細胞生長至80%～90%時，0.25%胰酶消化后按比例傳代。選取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、T47D人乳腺癌細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖檢測：MTT法觀察細胞增殖情況，將人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、T47D細胞接種于96孔板（1×104個細胞/孔），培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，分別運用1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL益氣扶正中藥（復方）干預細胞48 h，每一濃度做3個復孔，同時設陰性對照孔（只含細胞、培養(yǎng)液）；配置0.5% MTT溶液，每孔加20 μL，37 ℃溫育4 h后棄上清液，加入DMSO（150 μL/孔），震蕩10 min使其充分溶解后，用全自動酶標儀于波長490 nm處測得各孔OD值，檢測量效關系。計算復方藥物對細胞生長的抑制率，并繪制效應曲線，同樣的實驗重復3次。細胞生存率（%）=（OD藥物組-OD空白對照）/（OD藥物組-OD空白對照）×100%。用SPSS22.0軟件擬合估計IC50值。同樣的方法，運用10、20、40、80、160、320、640 nmol/mL PTX干預細胞48 h，觀察其對細胞增殖的抑制作用，計算IC50值。用64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞48 h再次檢測細胞存活率。

1.2.3 細胞凋亡檢測：用64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞，48 h后收集各藥物干預后的細胞，胰酶消化，1 000 r/min離心2 min，吸除上清液，PBS洗滌2遍，再次1 000 r/min離心2 min后提取細胞，加70%冰乙醇固定，4 ℃靜置過夜。取出固定的標本，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加PBS洗滌細胞2遍，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2遍。參照Annexin-v/PI細胞凋亡檢測試劑盒方法實驗，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot：提取各實驗組蛋白（64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞48 h），Bradford法定量后制備樣品，Western blot法檢測Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Cleaved caspase 3 蛋白的表達，β-actin作為內參。將等量蛋白樣品進行SDS-PAGE常規(guī)電泳、轉膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h后，棄去封閉液，加入一抗，封入雜交袋內，4 ℃搖蕩過夜。PBST清洗3次后，加入熒光二抗（1:10 000稀釋），避光培育1 h，PBST洗滌3次，加入化學底物助其顯影、Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)讀膜，分析各條帶灰度值。ImageJ軟件讀取各條帶灰度值。

另制備實驗組蛋白（64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞48 h），同法檢測TLR4、p-lκBα、NF-κB及β-actin蛋白，β-actin作為內參。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS22.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，以上實驗重復3次。計量資料以s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 扶正中藥與PTX對細胞增殖的影響 不同濃度扶正中藥干預乳腺癌細胞株MDA-MB-231、T47D，結果顯示扶正中藥對人乳腺癌細胞株的生長抑制作用較弱，當濃度達128 mg/mL時，細胞存活率約為80%，未達到IC50值，見圖1A。PTX為乳腺癌經典化療藥物，經MTT實驗證實，PTX對MDA-MB-231、T47D細胞株均有增殖抑制作用，但相同濃度（80、160、320、640 nmol/mL）的PTX對MDA-MB-231細胞株的殺傷作用弱于T47D細胞株，如當濃度達到160 nmol/L時，T47D細胞株的存活率約為44%，而MDA-MB-231細胞株的存活率約為75%，表現(xiàn)為耐藥，見圖1B。扶正中藥與PTX在處理MDA-MB-231細胞株時有協(xié)同作用。當160 nmol/L PTX聯(lián)合64 mg/mL的扶正中藥時，對T47D細胞株的殺傷效果沒有得到加強，而當作用于MDA-MB-231細胞株時，PTX的細胞殺傷作用得到加強，達到與T47D細胞株相同的抑制效果。見圖1C。

圖1 扶正中藥及PTX對T47D和MDA-MB-231細胞株細胞存活率的影響

2.2 扶正中藥與PTX誘導細胞凋亡 扶正中藥和PTX合用48 h對T47D細胞株聯(lián)合作用并不明顯，MDAMB-231細胞株中，凋亡率從23%增加到42%（P＜0.05），接近T47D細胞株PTX單藥所致的凋亡率46%。見圖2。在MDA-MB-231細胞株中Bax和Cleaved caspase 3蛋白經兩藥聯(lián)用后較單純用PTX表達增加（P＜0.05），而Bcl-2、Bcl-xL經兩藥聯(lián)用后表達減少（P ＜0.05）；而在T47D細胞株中兩藥聯(lián)用相較于單藥PTX并未改變Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Cleaved caspase 3蛋白的表達，見圖3。

2.3 扶正中藥通過TLR4/NF-κB信號通路增加PTX抗乳腺癌活性 Western blot檢測MDA-MB-231及T47D細胞株的TLR4的表達，結果顯示MDA- MB-231細胞株表達TLR4蛋白，而T47D細胞基本不表達TLR4蛋白。聯(lián)用扶正中藥與PTX相較于單用PTX，MDA-MB-231細胞株中TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白表達減少（P＜0.05），意味著TLR4/NF-κB信號通路的抑制。而T47D細胞株中并未看到TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白表達的改變。見圖4。

3 討論

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）屬于I型跨膜糖蛋白家族，廣泛分布于免疫細胞以及上皮細胞表面。人細胞表達10種TLRs亞型，其中以TLR4的腫瘤表達譜最為廣泛，與腫瘤關系最為密切[7]。有研究表明人乳腺癌組織TLR4高表達，促進乳腺癌細胞的增殖[8]。TLR4/NF-κB信號通路的異常激活不僅與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉移密切相關，還與腫瘤的化療耐藥有關。

PTX目前已成為卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多種常見惡性腫瘤的一線用藥。PTX以細胞內的微管蛋白為作用靶點，將細胞周期阻斷于G2/M期并誘導凋亡信號的激活，從而阻斷細胞分裂、阻止腫瘤細胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來研究顯示，PTX除了通過微管改變促進腫瘤細胞凋亡之外，還可以通過激活TLR4 信號途徑誘導腫瘤細胞耐藥[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在具有功能性TLR-MyD88通路的卵巢癌細胞（I型EOC細胞）中，用LPS或PTX活化TLR4信號，可使細胞存活的重要調節(jié)子xIAP（caspase-3和-9的主要抑制子）和磷酸化AKT的表達增加，促進了卵巢癌細胞生長和對藥物的抗性，且TLR4能夠介導PTX的黑色素瘤細胞耐藥[10]，據RAJPUT等[11]研究，多數(shù)乳腺癌臨床樣本和68%的乳腺癌細胞系中TLR4高表達，并且可能介導PTX誘導的乳腺癌化療耐藥。這與我們的研究相一致，TLR4高表達的MDA-MB-231細胞株表現(xiàn)為對PTX的耐藥，而不表達TLR4的T47D細胞株對PTX敏感。

圖2 扶正中藥促進PTX誘導MDA-MB-231細胞株的細胞凋亡

PTX在抗腫瘤的同時，可啟動TLR4/NF-κB信號通路的激活。TLR4可以識別多種配體，其中最主要的是來自革蘭氏陰性細菌細胞壁的LPS。目前認為PTX也是一種可被TLR4識別的非病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）分子。盡管PTX與LPS缺乏結構相似性，但兩者均能與TLR4結合激活MyD88依懶性信號途徑，從而誘導腫瘤細胞釋放多種細胞因子或上調抗凋亡信號等一系列的效應[12]。

中醫(yī)學認為，乳腺癌的發(fā)病機制為本虛標實，在應用中醫(yī)方劑時，應重視健脾益氣以輔助正氣，溫補肝腎以調攝沖任，同時兼顧理氣活血，散結解毒。臨床和基礎研究也發(fā)現(xiàn)中藥方劑如乳寧沖劑、乳癌術后方、乳寧II號等在防治乳腺癌復發(fā)轉移方面療效確切[13-16]。姜華等[17]也證實益氣活血復方可阻斷TLR4高表達，同時阻斷TLR4胞內信號轉導的MyD88依懶性途徑，抑制下游NF-κB以及各種相關基因表達，從而減少內皮細胞的損失以及各種炎癥反應的發(fā)生。此外，扶正方劑中的主藥白術具有抗炎、抗腫瘤的作用[18]。在本研究中，我們探討了扶正中藥協(xié)助PTX抗乳腺癌的作用機制。我們發(fā)現(xiàn)對于TLR4高表達的MDA-MB-231細胞株，扶正中藥可協(xié)同PTX的抗癌作用，逆轉其對PTX的耐藥，達到TLR4不表達的T47D細胞株對PTX的敏感度。而在TLR4不表達的T47D細胞株中，扶正中藥并不能起到聯(lián)合增效的作用。

Bcl-2家族成員是細胞凋亡調節(jié)因子，其中Bcl-2、Bcl-xL和Bax是關鍵的表現(xiàn)細胞生存/凋亡特征的因子[19]?？辜毎蛲龀蓡TBcl-2、Bcl-xL能夠改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，封閉Bax在線粒體上形成的孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用，最終抑制細胞凋亡。而Bax的增加會破壞Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡成員的活性，促進細胞凋亡[20]。caspase 3是細胞凋亡通路下游的執(zhí)行者，Cleaved caspase 3是caspase 3的激活形態(tài)，使細胞發(fā)生生化及形態(tài)學改變，導致細胞凋亡[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTX敏感細胞株T47D經PTX處理后，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達減少，而Bax、Cleaved caspase 3蛋白表達增加，細胞凋亡增加。而扶正中藥單藥處理細胞株T47D后，細胞凋亡未見明顯增加，另與PTX聯(lián)用后，亦未看到增強效果。而細胞株MDA-MB-231經PTX處理后，細胞凋亡有所增加，但未達到在細胞株T47D的程度，當加用扶正中藥后，可看到Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達進一步減少，Bax、Cleaved caspase 3蛋白表達進一步增加，提示扶正中藥在MDA-MB-231細胞株中可增加PTX誘導細胞凋亡的作用，這與流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果相一致。

圖3 扶正中藥促進PTX對MDA-MB-231細胞株細胞凋亡蛋白表達的影響

圖4 扶正中藥通過TLR4/NF-κB信號通路增加PTX抗乳腺癌活性

鑒于PTX的耐藥與TLR4激活下游NF-κB通路相關，我們檢測了TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表達改變?？梢钥吹剑贛DA-MB-231細胞株中加用PTX后，TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表達增加，意味著TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而對PTX產生耐藥。而當聯(lián)用扶正中藥與PTX后，TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表達受到抑制，TLR4/NF-κB信號通路受到抑制，MDA-MB-231細胞株對PTX重新變得敏感。而在TLR4不表達的T47D細胞株，TLR4/NF-κB信號通路并未發(fā)生改變。

綜上所述，MDA-MB-231細胞株中，扶正中藥可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路增加細胞凋亡，從而增加PTX對MDA-MB-231乳腺癌細胞株的細胞增殖抑制作用，逆轉對PTX的耐藥。而TLR4 不表達的T47D細胞株，對PTX敏感，聯(lián)用扶正中藥后并不能抑制TLR4/NF-κB信號通路，不能增加細胞凋亡，也不能加強PTX的細胞增殖抑制作用。