c(RGDyk)環(huán)肽修飾納米膠束逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤對(duì)多西他賽的耐藥性

吳其隆，蔡錦華，徐荷林，李慧，趙應(yīng)征，陳斌

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 超聲科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州325035）

多西他賽（docetaxel，DTX）是由歐洲漿果紫杉的針葉中提取的化合物半合成的紫杉醇衍生物。其作用機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管，并且防止去多聚化過(guò)程而使微管穩(wěn)定，阻滯細(xì)胞于G2和M期，抑制細(xì)胞的進(jìn)一步分裂，從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和增殖[1-2]。其對(duì)于乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、軟組織肉瘤均具有一定療效[3]。然而DTX存在水溶性差、脂溶性不強(qiáng)、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短以及耐藥性等缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。目前臨床上使用的DTX注射液是添加了非離子表面活性劑，如乙醇和聚山梨酯80（吐溫80），而這些表面活性劑容易導(dǎo)致骨髓抑制、過(guò)敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性以及溶血等不良反應(yīng)[4-5]。為了克服以上不足，已有報(bào)道將DTX制成脂質(zhì)體、納米粒、水凝膠、聚合物膠束等用于疾病的診斷和治療[6-9]。本研究以泊洛沙姆188（PL-188）為納米材料，因其在結(jié)構(gòu)上是一種三嵌段的聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物（PEO-PPO-PEO），以中間的PO鏈為疏水嵌段，兩端的EO鏈為親水嵌段，該聚合物能自發(fā)組成納米膠束。同時(shí)，已有報(bào)道證實(shí)泊洛沙姆可以逆轉(zhuǎn)多種類(lèi)型腫瘤的耐藥性，使一線化療藥物對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞的毒性增加2-3倍[10-11]。環(huán)狀c(RGDyk)短肽作為細(xì)胞整合素及其配體相互作用的識(shí)別位點(diǎn)，能與C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及人腦膠質(zhì)瘤U87耐藥細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的整合素αvβ3特異性結(jié)合[12-13]，提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷毒性。本實(shí)驗(yàn)以PL-188為原材料制備羧基化PL-188，將c(RGDyk)與其鍵合，構(gòu)建c(RGDyk)-PL-188靶向新材料。探索c(RGDyk)-PL-188自組裝形成膠束的能力以及其對(duì)DTX的包載性能，評(píng)價(jià)其對(duì)耐藥的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的靶向性與抗腫瘤效果。

1 材料和儀器

1.1 材料 DTX購(gòu)自上海龍翔生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購(gòu)自上海阿拉丁公司；2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK8）購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；c(RGDyk)環(huán)狀短肽購(gòu)自上海吉爾生化有限公司；C6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞購(gòu)自北京NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PL-188、DAPI試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器 FD-1C冷凍干燥機(jī)（北京德天佑有限公司），JEM-2100F透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），SpectraMax M3酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），馬爾文納米粒度電位儀Zetasizer Nano ZSP（英國(guó)Malvern公司），DSC差示掃描量熱儀（瑞士Mettler Toledo公司），Nikon正置熒光顯微鏡、Nikon倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 c(RGDyk)-PL-188 聚合物的合成與結(jié)構(gòu)確證兩步法合成c(RGDyk)-PL-188聚合物：首先，合成羧基化PL-188，稱(chēng)取9 g PL-188、0.54 g琥珀酸酐、0.27 g 4-二甲基氨基吡啶并量取0.5 mL三乙胺共溶于30 mL 1，4-二惡烷中，磁力攪拌使其完全溶解并在室溫下攪拌24 h。將混勻后的液體加入至透析袋內(nèi)（透析膜截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 Da），用蒸餾水透析72 h，前24 h每隔6 h換水1 次，后48 h每隔12 h換水1次，以除去混合液中的有機(jī)溶劑，凍干獲得羧基化PL-188（CT-P188）粉末；其次，合成c(RGDyk)-PL-188聚合物，稱(chēng)取0.1 g嗎啉乙磺酸（MES）溶解在10 mL蒸餾水中并攪拌10 min，向溶液中加入0.4 g EDC和0.2 g NHS攪拌直至完全溶解，加入0.3 g羧基化PL-188和0.02 g c(RGDyk)于室溫下磁力攪拌24 h，經(jīng)透析和凍干獲得c(RGDyk)-PL-188聚合物粉末。

利 用FT-IR 和1H-NMR 對(duì) 羧 基 化PL-188 和c(RGDyk)-PL-188聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。FT-IR分析以KBr粉末壓片制樣，KBr空白片扣除背景，掃描范圍4 000～800 cm-1。分辨率為4 cm-1，譜峰讀數(shù)精度為0.01 cm-1。1H-NMR分析在Bruker AV-600核磁共振儀上完成，所有樣品經(jīng)過(guò)DMSO-d6處理。

2.2 c(RGDyk)DTX-NPs的制備與篩選 采用納米沉淀法制備載DTX的靶向納米膠束[c(RGDyk)DTX-NPs]，稱(chēng)取100 mg c(RGDyk)-PL-188和一定量的DTX，溶于3 mL乙腈中，磁力攪拌使其完全溶解，作為有機(jī)相；在劇烈攪拌下，將5 mL蒸餾水緩慢滴入有機(jī)相中（約30 min）并繼續(xù)攪拌30 min使其混合均勻。將混勻后的液體加入至透析袋內(nèi)（透析膜截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 Da），用蒸餾水透析24 h，開(kāi)始每隔2 h換水1次，后每9 h換水1次以除去混合液中的有機(jī)溶劑，5 000 r/min離心除去藥物沉淀，獲得上清液，即為載DTX納米膠束c(RGDyk)DTX-NPs。固定材料每次用量為100 mg，選取不同總投藥量（2、5、10、20 mg），以考察最大的載藥量和包封率。同樣，稱(chēng)取100 mg PL-188和上述優(yōu)化后的DTX投藥量按照相同的方法制備DTX-NPs作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。

2.3 載藥量及包封率的測(cè)定 高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定藥物載藥量和包封率，量取500 μL c(RGDyk)DTX-NPs至5 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲波破壞膠束，乙腈定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣量為20 μL，采用Agilent1200高效液相色譜儀測(cè)定。HPLC條件：XTerra RP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈/水（47：53，v/v）；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫25 ℃。通過(guò)以下公式計(jì)算載藥量及包封率。

2.4 c(RGDyk)DTX-NPs的表征 動(dòng)態(tài)光散射激光粒度測(cè)定儀（dynamic light scattering，DLS）對(duì)空白納米膠束，c(RGDyk)DTX-NPs進(jìn)行粒徑和Zeta電位的測(cè)定。納米膠束水溶液過(guò)0.45 μm膜以除去灰塵，經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后，于常溫條件下固定激光波長(zhǎng)為632.8 nm，散射角為90°測(cè)定其粒徑以及Zeta電位。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測(cè)納米膠束形態(tài)，取空白納米膠束或載藥納米膠束滴于鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，以無(wú)纖維濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，置于TEM中以200 kV加速電壓檢視、拍照。差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析納米膠束內(nèi)藥物分散狀態(tài)，取適量c(RGDyk)DTX-NPs凍干樣品進(jìn)行DSC分析，起始溫度為0 ℃，升溫速度為5 ℃/min，終止溫度為250 ℃。c(RGDyk)-PL-188材料、DTX粉末、c(RGDyk)-PL-188和DTX的物理混合物同法測(cè)定，對(duì)照比較確定藥物分散狀態(tài)。

2.5 c(RGDyk)DTX-NPs穩(wěn)定性 為了考察c(RGDyk)DTX-NPs的粒徑與載藥穩(wěn)定性，c(RGDyk)DTX-NPs置于pH 7.4 PBS溶液和含有胎牛血清白蛋白（BSA）的pH 7.4 PBS中于37 ℃環(huán)境中振搖孵育不同時(shí)間，3 000 r/min離心5 min，取上清液適量按照2.3和2.4所述方法分別測(cè)定c(RGDyk)DTX-NPs的藥物濃度和粒徑。

2.6 c(RGDyk)DTX-NPs體外藥物釋放 采用動(dòng)態(tài)透析法對(duì)游離DTX溶液以及c(RGDyk)DTX-NPs的體外釋藥行為，取1 mL c(RGDyk)DTX-NPs加入至透析袋內(nèi)（透析膜截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 Da），扎緊并密封兩端，放置在含有0.5%吐溫-80的50 mL pH 7.4 PBS介質(zhì)中，置水浴搖床于37 ℃，120 r/min震搖，分別于2、4、6、8、10、12、24 h取1 mL釋放介質(zhì)，并補(bǔ)充1 mL相應(yīng)的新鮮釋放介質(zhì)，按照2.3所述的HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算累積釋放百分?jǐn)?shù)，繪制釋放曲線。

2.7 二維膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型評(píng)價(jià)

2.7.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：以C6膠質(zhì)瘤和耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株為模型，考察c(RGDyk)DTXNPs體外抗腫瘤效果。C6細(xì)胞培養(yǎng)條件為：使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株培養(yǎng)條件為：使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入1 μg/mL DTX以維持細(xì)胞耐藥性，于實(shí)驗(yàn)2周前停藥，培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2濃度為5%。待培養(yǎng)皿中細(xì)胞融合率達(dá)85%，使用含有0.25% EDTA的胰酶至培養(yǎng)皿中消化，對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.7.2 CCK8法細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：CCK8試劑盒檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤和耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株經(jīng)不同濃度的DTX溶液、DTX-NPs、c(RGDyk)DTX-NPs處理后的細(xì)胞活性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，用培養(yǎng)基稀釋至5×103個(gè)/mL細(xì)胞密度，經(jīng)過(guò)吹打后，以100 μL/每孔將細(xì)胞懸液接種在96孔板內(nèi)，將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。待貼壁后，每孔加入100 μL上述不同濃度的不同藥物的新鮮培養(yǎng)介質(zhì)，并設(shè)置一不做任何處理的空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將96孔板取出，吸出所有培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK8的混合液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用SpectraMax M3酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞的存活率（%）。

A加藥：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度；A0加藥：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度。

2.7.3 c(RGDyk)DTX-NPs細(xì)胞靶向性評(píng)價(jià)：為了觀察c(RGDyk)DTX-NPs對(duì)耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的靶向性，以熒光探針吲哚菁綠（ICG）代替DTX制備熒光標(biāo)記的c(RGDyk)ICG-NPs。耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株以1×105個(gè)/mL密度接種于含有載玻片的6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，移去培養(yǎng)液，加入ICG-NPs、c(RGDyk)ICG-NPs，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，移去含藥細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4 ℃ 1 mL PBS終止細(xì)胞攝取，并沖洗細(xì)胞3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛于4 ℃環(huán)境下固定細(xì)胞20 min，吸出固定液，繼續(xù)用1 mL PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5 min。加入0.5%曲拉通（Triton）于室溫下通透細(xì)胞15 min，PBS沖洗3次，加入含有DAPI染液（1 mg/mL）的抗熒光猝滅劑，封片后于正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取情況。另外，耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞先經(jīng)c(RGDyk)封閉，后加入c(RGDyk)ICG-NPs孵育2 h后，確定細(xì)胞內(nèi)熒光分布變化，進(jìn)一步確證其靶向性。

2.8 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞球評(píng)價(jià)

2.8.1 c(RGDyk)ICG-NPs對(duì)腦膠質(zhì)瘤腫瘤球生長(zhǎng)抑制：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DTX耐藥人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，0.25%胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)基、含鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL、bFGF 20 ng/mL、EGF 20 ng/mL以及B27添加物（1×）的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的濃度分別接種于低吸附塑料48孔板，并置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度以及培養(yǎng)液的顏色變化更換培養(yǎng)液。選擇大小均勻、圓整致密的腫瘤球，分別加入DTX溶液（10 μg/mL）、c(RGDyk)DTX-NPs（相當(dāng)于10 μg/mL DTX）對(duì)腫瘤球進(jìn)行處理，并以PBS溶液處理的腫瘤球作為對(duì)照組。于3、6、10 d后于倒置顯微鏡下觀察U87膠質(zhì)瘤腫瘤球的體積變化。

2.8.2 c(RGDyk)ICG-NPs對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞球滲透性：按照2.8.1方法培養(yǎng)DTX耐藥的人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞球，7 d后于顯微鏡下觀察細(xì)胞球的形態(tài)與大小，取大小均勻，圓整致密的細(xì)胞球進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。每孔加入ICG-NP或c(RGDyk)ICG-NPs，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，孵育完畢后移除培養(yǎng)液，用4 ℃ PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS再次沖洗3次，置于載玻片上，抗熒光猝滅劑封片后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡斷層掃描并拍照，觀察c(RGDyk)ICG-NPs對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞球滲透深度。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 c(RGDyk)-PL-188 聚合物合成和結(jié)構(gòu)確證c(RGDyk)-PL-188聚合物經(jīng)兩步法合成，首先以PL-188 為原材料經(jīng)琥珀酸酐羧基化后，合成制備得到CT-P188；CT-P188端羧基經(jīng)EDC/NHS活化后與c(RGDyk)環(huán)肽的氨基縮合，合成制備得到c(RGDyk)-PL-188 靶向材料。FT-IR和1H-NMR對(duì)CT-P188 和c(RGDyk)-PL-188結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，結(jié)果如圖1。相比PL-188的FT-IR譜圖（見(jiàn)圖1A），CT-P188的FT-IR結(jié)果除了出現(xiàn)PL-188骨架相關(guān)峰如3 300 cm-1（OH伸縮振動(dòng)），2 852 cm-1（CH2伸縮振動(dòng)）以及1 100 cm-1（C-O-C伸縮振動(dòng)），還出現(xiàn)了COOH相關(guān)的特征峰如1 735 cm-1（C=O伸縮振動(dòng)）。相比之下，c(RGDyk)-PL-188的FT-IR結(jié)果除了出現(xiàn)CT-P188相關(guān)峰外，還出現(xiàn)了c(RGDyk)相關(guān)的特征峰如1 650 cm-1（酰胺I帶）和1 580 cm-1（酰胺II帶）。相似，CT-P188的1HNMR圖譜（見(jiàn)圖1B）除了出現(xiàn)PL-188骨架相關(guān)峰如3.5 ppm（-OCH2CH2O-）以及1.3 ppm（-OCH2CH2CH2O-）外，還出現(xiàn)了琥珀酸相關(guān)特征峰如2.5 ppm（O=CCH2CH2-C=O）。相比之下，c(RGDyk)-PL-188的1H-NMR圖譜出現(xiàn)了c(RGDyk)相關(guān)峰如2.5～3.2 ppm峰。

圖1 c(RGDyk)-PL-188聚合物結(jié)構(gòu)表征

3.2 c(RGDyk)DTX-NPs的制備與處方篩選 c(RGDyk)-PL-188聚合物和DTX共溶于DMSO，在攪拌下滴入蒸餾水，自發(fā)納米沉淀自組裝，制備載DTX的納米膠束[c(RGDyk)DTX-NPs]?？刂浦苽溥^(guò)程中所用DMSO體積，聚合物投料以及攪拌速度等因素，改變處方中c(RGDyk)-PL-188聚合物/DTX比例，制備系列c(RGDyk)DTX-NPs。通過(guò)測(cè)定各配方下制備的納米膠束載藥量、包封率、粒徑和PDI、電位等指標(biāo)，篩選出最適處方。結(jié)果如表1 所示，隨著c(RGDyk)-PL-188/DTX質(zhì)量比從50:1升高至10:1，納米膠束中DTX的載藥量逐漸增大，而包封率則逐漸降低，粒徑稍有增大。但當(dāng)c(RGDyk)-PL-188/DTX增加至5:1時(shí)，納米膠束中DTX的載藥量反而降低，包封率則僅有22.6%，表明由于在該條件下藥物的超飽和狀態(tài)誘導(dǎo)快速藥物析出晶型不利于膠束包載。綜上分析，當(dāng)c(RGDyk)-PL-188/DTX質(zhì)量比為10:1時(shí)，所制備納米膠束具有較高的載藥量（7.88%±0.02%）和適當(dāng)?shù)陌饴剩?5.5%±2.78%），其粒徑（159.2 nm）相比空白膠束（115.6 nm）雖稍有增大，但仍小于200 nm，而且其具有較窄的粒徑分布（PDI=0.12）。因此，后續(xù)載DTX的納米膠束的穩(wěn)定性、體外釋放以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均以該處方進(jìn)行研究。

表1 不同聚合物和藥物投料質(zhì)量比對(duì)納米膠束載藥量、包封率、平均粒徑、PDI、Zeta電位的影響（n=3）

3.3 c(RGDyk)DTX-NPs的粒徑與形態(tài) 分別以DLS和TEM檢測(cè)c(RGDyk)DTX-NPs水化粒徑（Dh）、粒位分散指數(shù)（polymey disperse index，PDI）和形態(tài)。粒徑分布結(jié)果如圖2A、2B所示。相比空白c(RGDyk)-PL-188納米膠束[Dh=（115.6±0.2）nm，PDI=0.11]，c(RGDyk)DTX-NPs水化粒徑稍有增大，Dh為（159.2±0.2）nm，粒徑分布稍有變寬（PDI=0.12），表明藥物裝載在膠束核內(nèi)。膠束樣品經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后，通過(guò)TEM觀察c(RGDyk)-PL-188和c(RGDyk)DTX-NPs微觀形態(tài)。結(jié)果如圖2C、2D，c(RGDyk)-PL-188和c(RGDyk)DTX-NPs納米膠束均呈白色的球形粒子并且分布均勻，TEM測(cè)量的c(RGDyk)-PL-188脫水狀態(tài)下粒徑為55 nm，而c(RGDyk)DTX-NPs脫水粒徑則增大至65 nm，二者均顯著小于DLS測(cè)量的水化粒徑。這表明c(RGDyk)-PL-188材料自組裝的膠束外殼由致密的PEO親水鏈分布，在TEM測(cè)定前對(duì)樣品的干燥、脫水和抽真空等處理，使納米膠束水化層皺縮，納米膠束粒徑縮小[14]。

3.4 c(RGDyk)DTX-NPs藥物分散狀態(tài) DTX在水中溶解度極低，為高結(jié)晶藥物，而c(RGDyk)-PL-188材料納米膠束載藥量可達(dá)7.88%，顯著增加DTX在水中的溶解性。因此，本研究進(jìn)一步利用DSC檢測(cè)c(RGDyk)DTX-NPs中DTX分散狀態(tài)，為后續(xù)載藥穩(wěn)定性研究提供依據(jù)。DSC結(jié)果如圖3A所示，DTX原料藥在160 ℃出現(xiàn)晶體熔點(diǎn)吸熱峰，214 ℃處則為藥物熱降解峰；c(RGDyk)-PL-188聚合物材料在52 ℃則出現(xiàn)PEO鏈有關(guān)的吸熱峰；DTX與c(RGDyk)-PL-188聚合物材料的簡(jiǎn)單物理混合物則出現(xiàn)二者相關(guān)峰的疊加；相比之下，c(RGDyk)DTX-NPs則僅僅出現(xiàn)微弱的PEO有關(guān)吸熱峰，DTX相關(guān)的晶體熔點(diǎn)峰以及熱降解峰消失，表明DTX在膠束中以分子形式分散存在。c(RGDyk)-PL-188聚合物的PPO鏈與DTX間疏水作用可能是維持DTX在膠束內(nèi)高度分子分散穩(wěn)定存在的基礎(chǔ)。

圖2 納米膠束粒徑分布和TEM形態(tài)

3.5 c(RGDyk)DTX-NPs在模擬體液中的穩(wěn)定性 前已述及c(RGDyk)DTX-NPs中藥物以分子分散的高能態(tài)存在，為一種不穩(wěn)定存在形式，因此，本研究進(jìn)一步對(duì)c(RGDyk)DTX-NPs在含有BSA的pH 7.4 PBS介質(zhì)中粒徑和載藥穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果如圖3B、3C所示，c(RGDyk)DTX-NPs在pH 7.4 PBS溶液和含有BSA的pH 7.4 PBS溶液37 ℃連續(xù)孵育24 h，其粒徑與膠束內(nèi)藥物濃度沒(méi)有發(fā)生明顯變化，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)c(RGDyk)DTX-NPs粒徑維持在155～162 nm間，膠束內(nèi)藥物濃度變化小于10%，濃度維持在190 μg/mL以上。這些結(jié)果表明c(RGDyk)DTX-NPs在模擬體內(nèi)條件下，具有較好的納米形態(tài)與載藥穩(wěn)定性，為其靜脈注射腫瘤靶向提供前提依據(jù)。

3.6 體外藥物釋放 動(dòng)態(tài)透析法考察DTX在pH 7.4 PBS介質(zhì)中從c(RGDyk)DTX-NPs制劑體外釋放行為。結(jié)果如圖3D所示，相比DTX溶液劑，c(RGDyk)DTXNPs制劑展現(xiàn)出明顯的緩釋行為。DTX溶液劑在2 h內(nèi)累計(jì)釋放達(dá)到77.04%，12 h內(nèi)釋放高達(dá)91.71%，而在2 h內(nèi)c(RGDyk)DTX-NPs累計(jì)釋放僅為30.40%，12 h內(nèi)累計(jì)釋放僅為64.44%，甚至24 h釋放才達(dá)78.51%。膠束包裹產(chǎn)生的DTX短時(shí)緩釋行為有助于靜脈注射給藥后，c(RGDyk)DTX-NPs通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)靶向腫瘤組織，更適用于實(shí)際的治療需要。

圖3 c(RGDyk)DTX-NPs體外理化評(píng)價(jià)

3.7 體外細(xì)胞毒性 為了證實(shí)c(RGDyk)DTX-NPs對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)，本研究選擇兩種細(xì)胞株分別為耐DTX的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和敏感的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4 所示，c(RGDyk)-PL-188材料對(duì)兩種細(xì)胞株在測(cè)試濃度范圍內(nèi)均無(wú)毒性，各個(gè)濃度細(xì)胞存活率均大于90%。對(duì)敏感的C6細(xì)胞，含DTX的各種制劑包括DTX溶液、DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs均展現(xiàn)出濃度依賴的細(xì)胞毒性，IC50分別為6.65、4.53、3.02 μg/mL。這表明包裹在聚合物納米膠束中的藥物相對(duì)于單純藥物溶液具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其機(jī)制可能是膠束中的藥物以內(nèi)吞的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，使得更多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)靶位，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[15]。相比之下，耐DTX的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞則展現(xiàn)出明顯的耐藥性，DTX溶液制劑IC50為106.91 μg/mL，明顯高于敏感的C6細(xì)胞計(jì)算的IC50。但兩種DTX納米膠束制劑包括DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs對(duì)耐藥的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞則顯示出更明顯的濃度依賴性細(xì)胞毒性，IC50分別為13.46 μg/mL和8.26 μg/mL，明顯低于DTX溶液的IC50（P ＜0.05），表明納米膠束有效逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞對(duì)DTX的耐藥性。耐藥性的逆轉(zhuǎn)可能與膠束材料PL-188抑制耐藥P-gp介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。而且，c(RGDyk)DTX-NPs相比DTX-NPs在多個(gè)濃度點(diǎn)對(duì)耐藥的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞展現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。這是因?yàn)閁87膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜過(guò)多表達(dá)αvβ3整合素，能更特異性吞噬c(RGDyk)DTX-NPs，更多藥物繞開(kāi)多藥耐藥蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

3.8 c(RGDyk)ICG-NPs靶向性 為了進(jìn)一步確證c(RGDyk)-NPs對(duì)耐藥U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向性，以熒光探針I(yè)CG代替DTX裝載在納米膠束內(nèi)制備c(RGDyk)ICG-NPs，比較ICG-NPs和c(RGDyk)ICG-NPs在細(xì)胞內(nèi)分布的差異。結(jié)果如圖5所示，孵育2 h后，ICG-NPs處理僅有微弱的藥物分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。相比之下，c(RGDyk)ICG-NPs處理則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯紅色熒光分布，表明c(RGDyk)-NPs具有更強(qiáng)的細(xì)胞靶向性。這種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高濃度藥物攝取與其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性結(jié)果相一致。而耐藥U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞與c(RGDyk)溶液（10 μg/mL）預(yù)孵育2 h后再加入c(RGDyk)ICG-NPs進(jìn)行攝取檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光明顯減弱，表明c(RGDyk)ICG-NPs靶向機(jī)制與細(xì)胞表面αvβ3整合素結(jié)合有關(guān)。

圖4 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

圖5 U87 DTX耐藥細(xì)胞對(duì)不同ICG制劑的攝取結(jié)果（×200）

3.9 腫瘤球生長(zhǎng)抑制 研究報(bào)道，腫瘤干細(xì)胞是一種增殖失控的細(xì)胞，并且可能是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的根源[16-17]。因此我們通過(guò)構(gòu)建3D U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞球，體外考察了c(RGDyk)DTX-NPs對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果如圖6所示。在治療后的第10天，未加藥物的陰性對(duì)照組腫瘤球體積生長(zhǎng)迅速，體積是原發(fā)灶的2.47倍；相反，DTX溶液組延緩了U87膠質(zhì)瘤球體的生長(zhǎng)，其第10天的體積是第0天的1.73倍；與DTX溶液組相比，c(RGDyk)DTX-NPs組顯著增加了DTX對(duì)U87腫瘤球的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其第10天的體積是原發(fā)灶的0.5倍。表明c(RGDyk)的靶向性聯(lián)合納米膠束制劑能有效增加DTX對(duì)耐藥腫瘤的殺傷作用。

3.10 腫瘤球滲透實(shí)驗(yàn) 已有研究證實(shí)，腫瘤球與體內(nèi)實(shí)際腫瘤具有某些相似的特征，包括實(shí)體瘤內(nèi)部缺乏足夠的氧氣和養(yǎng)分、體內(nèi)藥物遞送可能遇到的細(xì)胞外基質(zhì)障礙等[18-20]。為了證實(shí)c(RGDyk)DTX-NPs在U87細(xì)胞三維實(shí)體腫瘤球中的滲透擴(kuò)散行為，以ICG代替DTX制備熒光標(biāo)記的c(RGDyk)ICGNPs通過(guò)激光共聚焦顯微鏡斷層掃描技術(shù)對(duì)U87腫瘤球進(jìn)行了考察。結(jié)果如圖7所示，ICG-NP、c(RGDyk)ICG-NPs分別與U87三維實(shí)體腫瘤球共孵育24 h后，ICG-NP組紅色熒光只在腫瘤球表面少量分布；而c(RGDyk)ICG-NPs組的紅色熒光不僅分布于腫瘤球表面，而且其熒光能夠均勻地滲透到腫瘤球的中心。這些結(jié)果表明，與ICG-NP相比，c(RGDyk)ICGNPs具有更強(qiáng)的靶向穿透能力，其對(duì)腫瘤的這種更深的滲透可能使DTX被傳遞到腫瘤球的核心，從而抑制腫瘤核心和表面的生長(zhǎng)，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)抑制作用。

圖6 耐DTX的U87腫瘤球的生長(zhǎng)抑制評(píng)價(jià)

4 結(jié)論

圖7 孵育24 h后ICG-NP（A）和c(RGDyk)ICG-NPs（B）在U87腫瘤球的滲透情況（×200）

本研究以PL-188為納米材料，利用其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，經(jīng)琥珀酸酐羧基化后，鍵合c(RGDyk)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水性DTX裝載，構(gòu)建了包載DTX納米膠束，初步探索其對(duì)耐DTX的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的抑制效果。結(jié)果表明該聚合物膠束對(duì)DTX具有一定的載藥量和包封率。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，c(RGDyk)DTX-NPs較DTX溶液能明顯延緩DTX的釋放，呈現(xiàn)緩釋釋放行為，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明該聚合物膠束能高效地逆轉(zhuǎn)U87耐藥細(xì)胞對(duì)DTX的耐藥性。藥物攝取實(shí)驗(yàn)表明該聚合物膠束可被U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速攝取，能顯著地增加后釋放的DTX在細(xì)胞中的濃度，可有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。體外腫瘤球?qū)嶒?yàn)也進(jìn)一步證明了該納米膠束能有效地滲透至腫瘤球核心進(jìn)而抑制U87腫瘤球的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步確定該納米膠束對(duì)動(dòng)物模型的效果，需要進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)以及藥動(dòng)學(xué)的研究。