抗腫瘤藥物體外藥效學(xué)評價結(jié)合細胞生物學(xué)實驗教學(xué)促進教研融合

蔡燕飛， 陳 蘊， 史勁松， 金 堅

（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122）

0 引 言

近年來隨著細胞生物學(xué)實驗技術(shù)和實驗方法的不斷更新與發(fā)展，細胞生物學(xué)已經(jīng)滲透到免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)等生命科學(xué)的多個分支學(xué)科，并逐漸成為現(xiàn)代生命科學(xué)中的一門重要的基礎(chǔ)前沿學(xué)科［1-2］。因此，對細胞生物學(xué)實驗課程體系的改革和建設(shè)是提高細胞生物學(xué)實驗教學(xué)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。

在例如細胞生物學(xué)這類基礎(chǔ)實驗教學(xué)中，傳統(tǒng)的驗證性實驗教學(xué)已顯現(xiàn)出諸多弊端，嚴重地影響了對學(xué)生綜合實驗素質(zhì)的培養(yǎng)。傳統(tǒng)的基礎(chǔ)實驗教學(xué)采取單一、填鴨式的教學(xué)方式，且僅傳授給學(xué)生一些基本的實驗技能和方法，在培養(yǎng)學(xué)生的綜合研究能力方面很少下工夫［3-5］。錢偉長先生曾說，“大學(xué)必須拆除教學(xué)與科研之間的高墻；教學(xué)沒有科研做底蘊，就是一種沒有觀點的教育，沒有靈魂的教育”。因此通過教研結(jié)合，將科研內(nèi)容引入到實驗教學(xué)過程中，促進科研與教學(xué)的有機結(jié)合，這樣不僅可以增加學(xué)生對科研知識的學(xué)習(xí)興趣，同時也有利于理論知識的鞏固，對培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和實踐能力意義重大。同時，也可以將教學(xué)過程中獲得的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化到科研成果中，幫助快速推進科研項目進展，兩者相互促進相互補充，一舉多得［6-8］。

為此，結(jié)合科研團隊的前期研究成果，設(shè)計了以“抗腫瘤藥物的體外藥效學(xué)評價”為主題的細胞生物學(xué)實驗。以經(jīng)典的廣譜抗腫瘤藥物阿霉素（Adrimycin，ADM）作為受試藥物，通過MTT 法檢測ADM對乳腺癌MCF-7 細胞、黑色素瘤B16 細胞、肺癌A549 細胞、卵巢癌A2780 細胞和肝癌Bel7402 細胞的半數(shù)致死劑量，并運用流式細胞術(shù)檢測ADM 對各種細胞的促凋亡能力，從而研究ADM 的抗腫瘤效果［9-13］。通過MTT 染色法測細胞活性是細胞生物學(xué)實驗中的基礎(chǔ)實驗，其實驗原理和操作步驟都是常規(guī)的，但是單一的實驗方法并不具備一定的創(chuàng)新性，如果通過教研結(jié)合，運用通用的實驗方法來解決一定的科研問題，如通過MTT法對化療藥物阿霉素進行體外藥效學(xué)評價，通過檢測多種腫瘤細胞對ADM 的藥物敏感性，從而探討ADM的抗腫瘤效果，那么開展該綜合性實驗的意義就大不相同了。同時引入先進的流式細胞技術(shù)進一步驗證ADM 的抗腫瘤效果的同時，也激發(fā)了學(xué)生對于科研的探索和熱情，有助于學(xué)生綜合實驗?zāi)芰Φ奶嵘?/p>

學(xué)生按照2 或3 人1 組，通過自行查閱文獻，確定藥物作用濃度，設(shè)計合理的實驗方案，實驗前期老師與學(xué)生開展一次討論會，評估各組實驗方案的科學(xué)性和可行性，并最終確定詳細的實驗方案。實驗結(jié)束后，教師收集各組學(xué)生的統(tǒng)計實驗結(jié)果，然后將所有數(shù)據(jù)發(fā)給每組學(xué)生，各組將全班數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并最后得出結(jié)論，提交實驗報告，最后以PPT 的形式分享實驗結(jié)果和實驗心得，并對該課程進行評價。

1 實驗?zāi)康暮驮?/h2>

抗腫瘤藥物的體外藥效學(xué)研究，就是利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，根據(jù)不同原理測定藥物的抗腫瘤作用，例如通過腫瘤細胞活性檢測、凋亡相關(guān)蛋白酶活性檢測、亞細胞形態(tài)改變等途徑鑒定藥物的抗腫瘤效果。本實驗通過經(jīng)典的MTT染色法檢測5 種不同來源的實體瘤細胞對ADM的敏感性，包括乳腺癌MCF-7 細胞、黑色素瘤B16 細胞、肺癌A549 細胞、胃癌A2780 細胞和肝癌Bel7402 細胞，并運用流式細胞術(shù)進一步檢測ADM 對各種細胞的促凋亡能力，從而研究ADM 的抗腫瘤效果［14-15］。

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。MTT溶解液能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490 nm 波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比，MTT染色法是最經(jīng)典的用于檢測體外細胞活性的方法。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。將Annexin V進行熒光素（FITC）標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，通過流式細胞技術(shù)就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來［16-17］。

2 實驗材料

2.1 細胞株

乳腺癌MCF-7 細胞、黑色素瘤B16 細胞、肺癌A549 細胞、卵巢癌A2780 細胞和肝癌細胞Bel7402 均來自江南大學(xué)藥學(xué)院科研實驗室，原始細胞均購自中科院上海細胞庫。

2.2 主要試劑

胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)液均購自Gibco 公司；PBS、青霉素鏈霉素溶液和胰蛋白酶均購自Hyclone公司；臺盼藍染色液、MTT 染色液和細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細胞計數(shù)儀、酶標儀、流式細胞儀等。

3 實驗方法

3.1 細胞培養(yǎng)

5 種細胞均培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液中，其中MCF-7 細胞中需額外添加10 μg ／ mL的胰島素，細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，0． 25%胰酶消化傳代。

3.2 MTT染色法測細胞活性

（1）細胞按照7 000 個／孔、每孔100 μL 鋪96孔板；

（2）培養(yǎng)過夜后，吸去上清液，按照設(shè)置的藥物濃度梯度加藥，每孔100 μL；

（3）藥物作用72 h后，每孔加10 μL 5 mg ／ mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；

（4）棄上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；

（5）用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值；

（6）根據(jù)吸光值計算細胞活率，運用Prism軟件，以藥物濃度的lg值為橫坐標，細胞活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，計算IC50 值。

3.3 Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測細胞凋亡

（1）藥物作用48 h后，消化細胞并計數(shù)，取1． 0 ×106個細胞離心，棄上清。

（2）用提前預(yù)冷的PBS 清洗兩遍，棄上清，再加入1 mL 1 × Binding Buffer，細胞重懸。

（3）從上述懸液中取100 μL 細胞懸液加入1． 5 mL離心管，避光條件下，先加入5 μL FITC染料，再加入5 μL PI染料，常溫避光孵育15 min。

（4）加入400 μL 1 × Binding Buffer 進行稀釋，在1 h內(nèi)將樣品在流式細胞儀中進行檢測。

（5）運用Flow J軟件進行數(shù)據(jù)分析。

3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

全部實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Graph Pad Prism5 進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以ˉx ± s 表示，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

4 實驗結(jié)果與討論

4.1 MTT染色法檢測腫瘤細胞對ADM的敏感性

將一個自然班按照2 或3 人／組進行分組，共15組，每3 組選擇一種腫瘤細胞進行實驗。實驗前期，學(xué)生自行調(diào)研文獻，制定詳細的實驗方案，在經(jīng)過與老師討論后確定最終的實驗方案。在MTT實驗過程中，學(xué)生根據(jù)調(diào)研自行設(shè)計藥物作用濃度梯度，計算好稀釋方法。圖1 所示為其中一組的MTT實驗結(jié)果，結(jié)果表明，隨著ADM藥物濃度的升高，人乳腺癌MCF-7 細胞的活率逐漸下降，該組藥物濃度設(shè)置較為合理，基本覆蓋了完全抑制到無抑制效果的全過程，擬合的曲線呈S型，經(jīng)計算ADM對人乳腺癌MCF-7 細胞的IC50 為0． 15 μmol／ L。表1 所示為將15 組實驗進行統(tǒng)計的結(jié)果，表明ADM具有明顯的廣譜抗腫瘤效果，對5 種不同的腫瘤細胞均具有一定的抑制作用，其中乳腺癌MCF-7 細胞對ADM 最為敏感，其IC50 值小于1． 0 μmol／ L，肝癌Bel7402 細胞對ADM最不敏感，其IC50值大于10 μmol／ L。

圖1 MTT法檢測人乳腺癌MCF-7細胞對ADM的敏感性

表1 5 種不同的腫瘤細胞對ADM的藥敏性檢測（ˉx ± s，n ＝3）

4.2 流式細胞術(shù)檢測ADM的促凋亡能力

運用Annexin V 聯(lián)合PI染色法檢測ADM的促凋亡能力。根據(jù)MTT 實驗的統(tǒng)計結(jié)果，選擇3 μmol／ L濃度的ADM作用于各種腫瘤細胞，48 h 后檢測細胞的凋亡情況。圖2 所示為其中一組的流式圖，結(jié)果顯示3 μmol／ L 的ADM 作用于乳腺癌MCF-7 細胞48 h后，活細胞比例為0． 73%，壞死細胞比例為10． 1%，早期凋亡細胞比例為1． 72%，晚期細胞凋亡比例為87． 5%。將15 組實驗進行統(tǒng)計，結(jié)果如表2 所示。結(jié)果顯示，3 μmol／ L 的ADM 使約90%的乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生凋亡，約50%左右的黑色素瘤B16 細胞和卵巢癌A2780 細胞發(fā)生凋亡，約20%左右的肺癌A549細胞發(fā)生凋亡，肝癌Bel7402細胞幾乎不發(fā)生凋亡，該實驗結(jié)果與藥敏性實驗結(jié)果相吻合，進一步驗證了ADM具有廣譜的抗腫瘤藥效果，但是對于不同來源的腫瘤其抗腫瘤效果有所差異，對乳腺癌MCF-7 細胞最為敏感，對肝癌Bel7402 細胞的敏感性較差。

圖2 ADM對人乳腺癌MCF-7細胞的促凋亡能力檢測

表2 ADM對5 種不同腫瘤細胞的促凋亡能力檢測（ˉx ± s，n ＝3）

5 結(jié) 語

通過經(jīng)典的MTT 染色法檢測5 種不同來源的實體瘤細胞對ADM 的敏感性，并運用流式細胞術(shù)進一步檢測ADM 對各種細胞的促凋亡能力，從而研究ADM的抗腫瘤效果。整個實驗過程中，學(xué)生通過文獻調(diào)研了解了抗腫瘤藥物抗腫瘤活性研究的基本方法和原理，通過細胞活性和細胞凋亡檢測，學(xué)生掌握了細胞培養(yǎng)的基本實驗操作技能，熟悉了倒置顯微鏡、離心機等簡單儀器的使用方法，了解了酶標儀、流式細胞儀等自動化儀器的檢測方法，經(jīng)過實驗設(shè)計、實驗實施、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析一系列連貫的鍛煉，學(xué)生的整體實驗操作能力、分析問題和解決問題的能力、科研創(chuàng)新能力均有了很大提升。

從課程實施和學(xué)生反饋結(jié)果來看，仍有以下幾個方面可以持續(xù)改進：①課程內(nèi)容需隨著科研進展進一步加深和完善。本科實驗教學(xué)項目應(yīng)與學(xué)科前沿的步調(diào)相一致，脫離科研的實驗教學(xué)已無法達到現(xiàn)代人才培養(yǎng)的要求；②持續(xù)改進教學(xué)方式。開放式教學(xué)是目前綜合實驗教學(xué)的新型教學(xué)模式，但其具體的方式方法還不夠成熟，還需要進一步摸索和改進；③實驗設(shè)施不斷完善。及時更新?lián)Q代科學(xué)儀器設(shè)備，緊跟時代發(fā)展的步伐；④優(yōu)化師資結(jié)構(gòu)。當代細胞生物學(xué)已滲透到多個分支學(xué)科，因此對于指導(dǎo)教師的專業(yè)要求也隨之改變，對于類似綜合性的實驗課程，指導(dǎo)教師的專業(yè)要求需更加廣泛。