羅漢松莖中總黃酮的提取工藝優(yōu)化及其含量測(cè)定

韋錦梅　陸梅元　韋秀梅　丘琴　黃鳳音　陳科成　甄漢深

摘要：采用超聲提取法提取羅漢松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don]莖中的總黃酮，通過單因素試驗(yàn)方法考察了提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溶劑體積、提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，篩選出羅漢松莖中總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝為70%乙醇、超聲提取1.0 h、料液比1∶20（m/V）。超聲提取法提取羅漢松莖中總黃酮含量，該方法重復(fù)性較好、穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞：羅漢松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don];莖;總黃酮;提取工藝

中圖分類號(hào)：R282.2 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）18-0098-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.024 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of extraction technology and content determination of total flavonoids from Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don

WEI Jin-mei1，LU Mei-yuan2，WEI Xiu-mei3，QIU Qin1，HUANG Feng-yin1，CHEN Ke-cheng1，ZHEN Han-shen1

（1.School of Pharmaceutical Sciences，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China;2.Guangxi Food and Drug Evaluation and Inspection Center，Nanning 530200，China;3.Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Liuzhou 545001，Guangxi，China）

Abstract： The total flavonoids of the stem of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don was extracted by ultrasonic extraction， and the effects of extraction methods， solvent concentration， extraction sdvent volume and extraction time on total flavonoids were investigated by single factor test. Orthogonal experiment was used to optimize the extraction process and select the best extraction process of total flavonoids from the stem of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don. The results showed that the best extraction technology was 70% ethanol， ultrasonic extraction of 1.0 h， and the ratio of material to liquid 1∶20（m/V）. The ultrasonic extraction method can be used to ?extract the total flavonoids of the stem of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don. The method has good reproducibility， stability and feasibility.

Key words： Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don; stem; total flavonoids; extraction technology

羅漢松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don]又名土杉，短葉土杉，是羅漢松科羅漢松屬植物，主要分布在中國的廣西、廣東、湖南、貴州、江蘇、浙江、福建等地[1]，在廣西北海已經(jīng)大規(guī)模種植羅漢松。據(jù)《中藥志》記載，羅漢松性平、味淡，具有黃酮類、揮發(fā)油、萜類化合物等成分，臨床上具有補(bǔ)中益氣、祛風(fēng)除濕、涼血止血的功效，用于治療關(guān)節(jié)腫痛、心胃氣痛、咳血吐血等病癥[2]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，植物中廣泛存在的黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗病原微生物活性、改善心肌供血和抗抑郁等作用[3-8]，還具有抗腫瘤、抗心血管疾病、糖尿病、抗感染和抗病毒等藥理作用[9-14]。此外，羅漢松內(nèi)生的真菌對(duì)寄主植物的病蟲害具有一定的防御作用[15]。

目前，國內(nèi)外鮮見對(duì)羅漢松莖中總黃酮含量測(cè)定的相關(guān)研究，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，本試驗(yàn)建立了羅漢松莖中總黃酮含量的測(cè)定方法，為建立羅漢松科學(xué)、合理、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。生物總黃酮是藥用價(jià)值較高的天然資源，中國擁有豐富的生物總黃酮資源，測(cè)定羅漢松莖中總黃酮的含量，并比較廣西不同產(chǎn)地羅漢松莖中總黃酮的含量差異，以完善羅漢松藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本研究以羅漢松莖中的總黃酮含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察了提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溶劑體積、提取時(shí)間對(duì)提取藥材中總黃酮含量的影響，再采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)選最佳提取工藝，為研究羅漢松提供參考依據(jù)。同時(shí)對(duì)廣西境內(nèi)6批不同產(chǎn)地的羅漢松莖總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，為羅漢松藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，也為研究羅漢松藥材的質(zhì)量控制新方法奠定一定的基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器

UV1780型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）;法國默克密理博純水儀;XS105D十萬分之一天平（梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）;DFT-1000高速萬能打粉機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）;KQ5200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 ?試藥

蘆丁（批號(hào)：170224），純度>98%，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;其余試劑均為分析純。藥材來源見表1，經(jīng)廣西一心醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司馬利飛中藥師鑒定為羅漢松，經(jīng)60 ℃烘干，備用。

1.3 ?方法與結(jié)果

1.3.1 ?對(duì)照品溶液的配制 ?精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品適量，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容至刻度，振蕩搖勻，配成0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.3.2 ?樣品溶液制備 ?取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加70%乙醇20 mL稱定重量，超聲提取1.0 h，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取過濾液1 mL置于25 mL容量瓶中，即得樣品溶液。

1.3.3 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 ?精密稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁對(duì)照品5 mg，加70%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%氫氧化鈉4.0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，然后在波長(zhǎng)508 nm處測(cè)定吸光度。得到直線方程為y=11.164x-0.011 3，R2=0.999 1，在0.01～0.08 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.3.4 ?方法學(xué)考察

1）精密度試驗(yàn)。精密稱取廣西那坡縣產(chǎn)的羅漢松藥材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法進(jìn)行顯色測(cè)定。于波長(zhǎng)508 nm處連續(xù)測(cè)定6次吸光度，結(jié)果RSD為1.63%，該方法精密度良好。

2）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取廣西那坡縣產(chǎn)的羅漢松藥材樣品6份，每份藥材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法進(jìn)行顯色測(cè)定。于波長(zhǎng)508 nm處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算藥材的平均含量為23.16 mg/g，RSD為2.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取廣西那坡縣產(chǎn)的羅漢松藥材粉末1.0 g，按“1.3.2”操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法進(jìn)行顯色測(cè)定。于508 nm波長(zhǎng)處分別在0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度，計(jì)算藥材的RSD為2.08%，結(jié)果表明，吸收度在60 min內(nèi)基本不變，可見樣品在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

4）加樣回收率試驗(yàn)。稱取羅漢松藥材粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，加入蘆丁對(duì)照品11.58 mg，按“1.3.2”操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法進(jìn)行顯色測(cè)定。于波長(zhǎng)508 nm處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。平均回收率為98.96%，RSD為2.65%（n=6），該方法回收率良好。

1.4 ?單因素試驗(yàn)

1.4.1 ?提取方法選擇 ?取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，以提取時(shí)間1.0 h、20 mL 70%乙醇為提取條件，分別采用回流提取法、超聲提取法和溶劑浸漬法對(duì)藥材總黃酮進(jìn)行提取，按“1.3.2”操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法進(jìn)行顯色測(cè)定。結(jié)果顯示，超聲提取與回流提取的提取率都比溶劑浸漬法的提取率高，且超聲提取與回流提取的提取率基本無差異，考慮到操作方便與節(jié)能，選擇超聲提取方法。

1.4.2 ?乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)選擇 ?取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，以提取時(shí)間1.0 h、20 mL不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑為提取條件，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、60%、70%、80%和95%，采用超聲提取法測(cè)定藥材總黃酮得率。

1.4.3 ?乙醇溶劑提取體積選擇 ?取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，以提取時(shí)間1.0 h、70%乙醇為提取條件，采用超聲提取法，取不同體積70%乙醇10、20、30、40、50、60 mL進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定藥材總黃酮得率。

1.4.4 ?提取時(shí)間選擇 ?取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，以70%乙醇30 mL為提取條件，采用超聲提取法，以提取時(shí)間對(duì)藥材總黃酮得率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，設(shè)提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，測(cè)定藥材總黃酮得率。

1.5 ?正交試驗(yàn)

從羅漢松莖中提取總黃酮的方法主要包括有機(jī)溶劑提取法、浸漬法[16，17]。參考《中國藥典》2015年版相關(guān)方法，選擇乙醇為溶劑的提取方法，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40）（質(zhì)量∶體積，下同）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0 h）3個(gè)條件，選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

精密稱取羅漢松藥材粉末1.0 g，精密稱定，按照上述羅漢松莖中總黃酮的提取方法進(jìn)行提取，再按L9（34）正交試驗(yàn)方案，使用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)羅漢松莖中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用70%乙醇超聲提取，羅漢松莖中總黃酮得率為2.19%，含量最高，達(dá)到21.94 mg/g;不同乙醇溶劑提取體積單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇溶液提取體積為30 mL時(shí)羅漢松莖中總黃酮得率2.35%，含量最高，達(dá)到23.53 mg/g;不同提取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間為1.0 h時(shí)，羅漢松莖中總黃酮得率為2.17%，含量最高，達(dá)到21.66 mg/g。

2.2 ?正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知，以羅漢松莖中總黃酮含量為試驗(yàn)指標(biāo)，各試驗(yàn)因素對(duì)羅漢松總黃酮提取效果的影響程度不同。直觀分析結(jié)果（表3）表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)總黃酮的提取工藝有明顯影響，其次是提取時(shí)間;方差分析結(jié)果（表4）表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)羅漢松莖中總黃酮提取有顯著影響，而提取時(shí)間無顯著影響，且各因素影響的強(qiáng)弱為A>B>C，考慮試驗(yàn)效率和時(shí)間，選擇提取時(shí)間為1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B1C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，超聲提取時(shí)間1.0 h，此時(shí)提取效果最佳。

2.3 ?樣品含量測(cè)定

精密稱取羅漢松藥材莖部粉末3份，每份1.0 g，置于錐形瓶中，按“1.3.2”操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法進(jìn)行顯色測(cè)定，使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其總黃酮含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，廣西合浦縣、南寧市產(chǎn)的羅漢松總黃酮含量較高，分別達(dá)到25.57、24.18 mg/g，是較好的用于提取總黃酮的藥材。

3 ?討論

以中藥羅漢松莖為研究對(duì)象，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間3個(gè)影響因素，采用超聲提取法來提取羅漢松莖中總黃酮，利用L9（34）正交試驗(yàn)的方法來優(yōu)選出羅漢松莖中總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，超聲法提取羅漢松莖中總黃酮的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，提取時(shí)間1.0 h，此提取效果最佳，為優(yōu)化超聲法提取羅漢松莖中總黃酮的工藝提供了參考依據(jù)。

在相同試驗(yàn)條件下，加入等量同體積分?jǐn)?shù)的乙醇可能會(huì)出現(xiàn)提取效率不一致的狀況。具體原因可能是羅漢松的莖接觸乙醇溶劑的面積不一樣。但是在加入相同質(zhì)量的羅漢松莖的情況下，加入乙醇的量越多，對(duì)提取的效率有正向影響。除此之外，還可以考察更多的試驗(yàn)因素，如提取溫度、溶劑pH和提取次數(shù)等，并且每個(gè)因素也可以通過單因素考察法確定出試驗(yàn)水平范圍，再通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選出提取工藝。

用超聲法提取羅漢松莖中的總黃酮，適宜的超聲提取條件可以提高總黃酮的得率。由于超聲波的空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)等共同的作用下，羅漢松莖中總黃酮的溶出速度加快，提高了提取效率。

廣西不同產(chǎn)地羅漢松莖中總黃酮含量差異較大，廣西合浦縣的羅漢松莖中總黃酮含量最高，其次是廣西南寧市，而廣西全州縣和廣西百色市的羅漢松莖中總黃酮含量較低。羅漢松自然資源豐富，在臨床應(yīng)用中廣泛使用，對(duì)羅漢松莖中有效成分的開發(fā)有待加強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳魯東，梁小洪，李書淵.羅漢松的生藥學(xué)研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2012，19（8）：1350-1352.

[2] 鄭玉蓉，吳慧儀，潘素靜，等.羅漢松葉中總黃酮的提取與純化富集工藝研究[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，33（1）：23-27.

[3] SATO K，SUGAWARA K，TAKEUCHI H，et al. New cytotoxic nor and bisnorditerpene dilactones，makilactones A-D，from Podocarpus macrophyllus D. Don[J].Heterocycles，2009，78（6）：1453-1462.

[4] 張 ?慧，張 ?云，房燕茹，等.植物黃酮類化合物的藥理活性研究進(jìn)展[J].石化技術(shù)，2017（6）：211.

[5] 趙薪苑，陳 ?婧，方建國，等.中藥和天然藥物中黃酮抗病毒活性及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，37（4）：410-415.

[6] SATO K，SUGAWARA K，TAKEUCHI H，et al.Antibacterial novel phenolic diterpenes from Podocurpus mucrophyllus D.DON.[J].Chem Pharm Bull，2008，56（12）：1691-1697.

[7] 張 ?敏.中藥黃酮成分抗抑郁治療作用研究進(jìn)展[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，16（5）：617-620.

[8] PARK H，KAI N，F(xiàn)UKAYA H，et al. New cytotoxic nordi-terpene dilactones from leaves of Podocurpus mucrophyllus var. maki[J].Heterocycles，2004，63（2）：347-357.

[9] 馬 ?銳，吳勝本.中藥黃酮類化合物藥理作用及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥物警戒，2013，10（5）：286-290.

[10] 祝寅淏，王 ?帥，李 ?瑤，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，39（3）：219-223.

[11] 張丹萍，丁 ?丁.黃酮類化合物藥理作用的研究[J].北方藥學(xué)，2015，12（8）：150-151.

[12] 程秋月，郭 ?菁，張成義.黃酮類化合物藥理作用的研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，12（2）：180-183.

[13] MACHHA A，ACHIKE F I，MUSTAFA A M，et al. Quercetin，a flavonoid antioxidant，modulates endothelium-derived nitric oxide bioavailability in diabetic rat aortas[J].Nitric oxide，2007，16（4）：442-447.

[14] 陳 ?凱，陳 ?錢，黃成然，等.植物總黃酮抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（4）：293-296.

[15] 王國平，王麗薇.一株羅漢松內(nèi)生真菌及其活性代謝產(chǎn)物[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（2）：287-292.

[16] 魏江存，陳 ?勇，謝 ?臻，等.10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的工藝優(yōu)化與含量測(cè)定[J].中國藥房，2017，28（34）：4792-4795.

[17] 魏江存，陳 ?勇，謝 ?臻，等.紫外-可見分光光度法測(cè)定生大黃和醋大黃的總蒽醌含量[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，38（6）：88-92.