艾草水提取物對(duì)大腸桿菌的抑制機(jī)理初步研究

張赟　張濤　羅婷　唐紅楓

摘要：以革蘭氏陰性菌大腸桿菌（Escherichia coli）作為試驗(yàn)菌，通過測(cè)定艾草（Artemisia argyi Lévl. et Van.）水提物與大腸桿菌作用前后細(xì)菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率、總糖和總蛋白的變化，闡明艾草水提物對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，艾草水提物（3 g/mL）對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用，其最低抑制濃度（MIC）為濃縮液的32倍稀釋物。經(jīng)艾草水提物處理后，大腸桿菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率、總糖濃度、蛋白質(zhì)濃度均增大，表明艾草水提物可破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流出，對(duì)培養(yǎng)液中相關(guān)生理生化指標(biāo)造成影響。

關(guān)鍵詞：艾草（Artemisia argyi Lévl. et Van.）水提物;大腸桿菌（Escherichia coli）;電導(dǎo)率;抑菌機(jī)理

中圖分類號(hào)：R285 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）18-0045-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.011 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Preliminary study on antimicrobial mechanism of Artemisia argyi

aqueous extract on Escherichia coli

ZHANG Yuna，ZHANG Taoa，LUO Tinga，TANG Hong-fenga，b

（a.College of Life Science and Chemistry;b.The Key Laboratory of Applied Biotechnology，Wuhan Donghu University，Wuhan 430212，China）

Abstract： Using Escherichia coli as test bacteria， change of Escherichia coli culture fluid conductivity， total sugar and soluble protein were determined in aqueous extract of Artemisia argyi. The results showed that Artemisia argyi aqueous extract （3 g/mL） had stronger inhibitory effect on Escherichia coli. The minimal inhibitory concentration （MIC） was 32 times the dilution of the Artemisia argyi aqueous extract （3 g/mL）. Under Artemisia argyi aqueous extract， Escherichia coli culture solution conductivity increased， the total sugar concentration and protein concentration increased. These results showed that the Artemisia argyi aqueous extract can damage the cell membrane of Escherichia coli， caused the cells to flow out. Therefore， the related physiological and biochemical indexes in the culture medium were affected.

Key words： Artemisia argyi aqueous extract; Escherichia coli; conductivity; antimicrobial mechanism

艾草（Artemisia argyi Lévl. et Van.），別名蕭茅、冰臺(tái)、艾絨等，多年生草本或略成半灌木狀，植株有濃烈香氣。莖褐色或灰黃褐色，基部稍木質(zhì)化，上部草質(zhì)，并有少數(shù)短的分枝，葉厚紙質(zhì)，上面被灰白色短柔毛，基部通常無假托葉或極小的假托葉;上部葉與苞片葉羽狀半裂、頭狀花序橢圓形;花冠管狀或高腳杯狀，外面有腺點(diǎn)，花藥狹線形，花柱與花冠近等長(zhǎng)或略長(zhǎng)于花冠;瘦果長(zhǎng)卵形或長(zhǎng)圓形，全草入藥。藥理研究表明，艾草有平喘止咳、止血凝血、抵抗病菌等作用[1，2]。中醫(yī)理論認(rèn)為艾葉具有理氣，散寒，溫經(jīng)，止血等功效。艾草提取物已經(jīng)被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的藥理研究證明其抗菌譜較寬，能夠有效抑制甚至殺死很多細(xì)菌和病毒，能在一定程度上抵御呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3，4]。艾草強(qiáng)大的殺菌能力來源于莖葉中含有豐富的揮發(fā)油等物質(zhì)，其能強(qiáng)烈抑制大腸桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等的生長(zhǎng)繁殖[5-7]。

艾草作為綠色、純天然、可食用的野生中草藥，在中國分布廣泛，開發(fā)其營(yíng)養(yǎng)、藥用和商用價(jià)值的前景十分廣闊。本試驗(yàn)采用水提法提取艾草莖葉部分中具有抑菌殺菌的成分，對(duì)艾草水提物的抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，以對(duì)其十分敏感的大腸桿菌作為研究對(duì)象，為艾草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗(yàn)材料 ?艾草采自武漢東湖學(xué)院中草藥試驗(yàn)大棚。試驗(yàn)菌種為大腸桿菌（Escherichia coli），由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。本試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?LB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15～20 g）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、去離子水1 000 mL、pH 7.0，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min，備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?原料預(yù)處理 ?采摘新鮮的艾草，要求艾草未開花、長(zhǎng)勢(shì)良好，未噴灑農(nóng)藥等，去除艾草的根、枯葉等雜質(zhì)，將其置于鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘烤直至干燥（約48 h）。將干燥的艾草取出用剪刀處理成約2 cm長(zhǎng)的小段并存放于自封袋中置于干燥通風(fēng)處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?濃縮液的制備 ?準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的艾草100 g于錐形瓶中，料液比（m∶v）為1∶20，浸提溫度為50 ℃，浸提時(shí)間為8 h，使用雙層濾紙抽濾后將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮獲得3 g/mL艾草水提物濃縮液，將濃縮液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ?最低抑制濃度（MIC）的測(cè)定 ?將實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3次，獲得活力較高的菌株后，接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)至濃度為1×107 CFU/mL。

將3 g/mL艾草水提物用LB液體培養(yǎng)基，采用倍比稀釋法依次稀釋4、8、16、32、64、128倍，同時(shí)等量接種0.1 mL活化的大腸桿菌菌懸液，將其置于搖床中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過夜，同時(shí)設(shè)置3組平行，觀察各試管渾濁（表示顯著長(zhǎng)菌）或判定澄清（表示未長(zhǎng)菌）程度，確定最低抑制濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.4 ?抑菌圈法測(cè)定抑菌效果 ?采用濾紙片法，在無菌操作臺(tái)中吸取50 μL已活化的大腸桿菌菌懸液于LB固體平板中央，涂布。將平板正向置于無菌操作臺(tái)中，待LB固體平板將菌液吸收至無流動(dòng)液體存在后，取已滅菌的干燥濾紙片，將其分別置于稀釋4、8、16、32、64倍的濃縮液中浸泡1 min后，分別貼于涂有大腸桿菌菌懸液的LB固體平板中，濾紙片邊緣離平板邊緣距離應(yīng)大于1 cm，將用無菌水浸泡的濾紙片作為對(duì)照組，后將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)置3個(gè)平行。采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈大小，求平均值，確定艾草水提物對(duì)大腸桿菌的抑菌能力。

2.2.5 ?艾草濃縮液對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響 ?將活化后的大腸桿菌接種到不同濃度艾草濃縮液的LB液體培養(yǎng)基中，將其置于搖床中，在37 ℃、170 r/min的條件下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間使用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm時(shí)的吸光度（A600 nm），繪制生長(zhǎng)曲線。對(duì)照組加等量無菌水，同時(shí)向空白培養(yǎng)基加入等量等濃度濃縮液以消除濃縮液對(duì)A600 nm的影響。

2.2.6 ?上清液電導(dǎo)率的測(cè)定 ?向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的菌懸液試驗(yàn)組加入0.5 mL濃縮液（濃度由“2.2.3”的結(jié)果確定），對(duì)照組加入等量無菌水，同時(shí)向空白培養(yǎng)基加入等量等濃度濃縮液以消除濃縮液對(duì)體系電導(dǎo)率的影響。每隔一段時(shí)間取菌液1 mL，于4 000 r/min離心2 min，取上清液，使用電導(dǎo)儀測(cè)定上清液的電導(dǎo)率。

2.2.7 ?上清液可溶性總糖的測(cè)定 ?向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的菌懸液試驗(yàn)組加入0.5 mL濃縮液（濃度由“2.2.3”的結(jié)果確定），對(duì)照組加等量無菌水，同時(shí)向空白培養(yǎng)基加入等量等濃度濃縮液以消除濃縮液對(duì)體系總糖的影響。每隔一段時(shí)間取0.2 mL菌懸液，于4 000 r/min離心2 min，取上清液，采用苯酚-硫酸法[8]測(cè)其上清液可溶性總糖濃度，平行測(cè)定3組求平均值，確定抑菌物質(zhì)對(duì)菌液總糖含量的影響。

2.2.8 ?上清液總蛋白的測(cè)定 ?向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的菌懸液試驗(yàn)組加入0.5 mL濃縮液（濃度由“2.2.3”的結(jié)果確定），對(duì)照組加等量無菌水，同時(shí)向空白培養(yǎng)基加入等量等濃度濃縮液以消除濃縮液對(duì)體系蛋白質(zhì)的影響，每隔一段時(shí)間取菌液1 mL，于4 000 r/min離心2 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]測(cè)定抑菌物質(zhì)對(duì)菌液上清液可溶性蛋白的影響。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?最低抑制濃度（MIC）的確定

由表1可知，艾草水提物對(duì)大腸桿菌的最低抑制濃度（MIC）為32倍，表示當(dāng)濃縮倍數(shù)在不高于32倍，即藥物濃度為0.094 g/mL時(shí)，均有抑菌作用，且抑菌效果明顯。此試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)測(cè)定培養(yǎng)液電導(dǎo)率、總糖、可溶性蛋白的艾草提取物脅迫濃度。

2.2 ?抑菌圈試驗(yàn)測(cè)定艾草水提物的抑菌能力

由表2可知，當(dāng)艾草的水提物濃縮液稀釋倍數(shù)在32倍及以內(nèi)時(shí)出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而在稀釋64倍時(shí)，有兩組試驗(yàn)中未出現(xiàn)抑菌圈，表明在此稀釋倍數(shù)下濾紙片中的抑菌物質(zhì)的含量不足以抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)和繁殖。同時(shí)稀釋4、8、16倍時(shí)，抑菌圈直徑呈直線下降，表明所形成的抑菌圈大小存在顯著差異，此時(shí)濾紙片中的抑菌物質(zhì)含量差別較大。此結(jié)果可與最低抑制濃度的測(cè)定試驗(yàn)相互印證。

2.3 ?濃縮液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性

大腸桿菌在2 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)大腸桿菌生長(zhǎng)活躍，代謝旺盛，菌體活性較高。較高的代謝水平也有利于抑菌物質(zhì)及時(shí)作用于菌體（圖1），所以在培養(yǎng)3 h后將LB液體培養(yǎng)基中艾草水提物濃度調(diào)整為32倍稀釋液，以檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，研究艾草水提物對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理。由圖1可知，當(dāng)向菌懸液中加入濃縮液后（3 h），試驗(yàn)組大腸桿菌繁殖基本停止，在濃縮液加入后的2 h內(nèi)有部分菌體死亡導(dǎo)致菌懸液濃度降低，所以這段時(shí)間菌懸液的各項(xiàng)指標(biāo)受菌體死亡帶來的影響最大，也是檢測(cè)體系中生理生化指標(biāo)進(jìn)而確定艾草水提物抑菌機(jī)理的最佳時(shí)間段。據(jù)此，后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)均在此基礎(chǔ)上進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)定，以獲得最準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。未加抑菌物質(zhì)的對(duì)照組大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在檢測(cè)期內(nèi)均處于快速繁殖階段，進(jìn)一步說明試驗(yàn)組大腸桿菌的生長(zhǎng)停滯甚至死亡是由此試驗(yàn)的惟一變量因素導(dǎo)致的，即艾草水提物可影響大腸桿菌正常的生長(zhǎng)繁殖。

2.5 ?經(jīng)濃縮液處理后上清液電導(dǎo)率的變化

細(xì)胞膜作為細(xì)菌的保護(hù)屏障，為細(xì)菌提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，保護(hù)細(xì)菌在外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)自身仍能進(jìn)行生命活動(dòng)。而當(dāng)外界環(huán)境對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)不利或者存在抑菌物質(zhì)時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性就會(huì)遭到破壞，喪失其選擇透過性等功能，同時(shí)流動(dòng)性降低，細(xì)胞質(zhì)中所含的部分離子（如Na+、K+等）大量進(jìn)入到液體培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基的電導(dǎo)率上升，此時(shí)，通過離心獲得培養(yǎng)物的上清液，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化情況可由其電導(dǎo)率的變化直接反映出來[10-12]。由圖2可知，當(dāng)向菌液中加入艾草水提取物后，LB液體培養(yǎng)基上清液電導(dǎo)率明顯升高，且隨著艾草水提取物對(duì)大腸桿菌作用時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率持續(xù)增加，在加入艾草水提液1 h后電導(dǎo)率變化速率明顯升高，試驗(yàn)組上清液的電導(dǎo)率在加入抑菌物質(zhì)2.5 h后電導(dǎo)率達(dá)到最大。說明經(jīng)過艾草水提取物處理的大腸桿菌隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)均有胞質(zhì)滲漏，且胞質(zhì)滲漏速度不斷加快，在加入艾草水提物2.5 h后導(dǎo)致大部分菌體細(xì)胞破損。試驗(yàn)結(jié)果說明艾草提取物的抑菌性能穩(wěn)定，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到破壞大腸桿菌細(xì)胞壁、抑菌的目的。

2.6 ?經(jīng)濃縮液處理后上清液總糖含量的變化

糖類在微生物生長(zhǎng)繁殖過程中發(fā)揮著無可替代的作用，它是微生物的能源儲(chǔ)備物質(zhì)和首要的碳源。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)成分充足時(shí)，微生物會(huì)吸收利用外源的糖類等物質(zhì)供自身生長(zhǎng)繁殖的需要，而當(dāng)外界環(huán)境的改變（如存在抑菌物質(zhì)）使其膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)（如糖類等）物質(zhì)會(huì)發(fā)生外泄，導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)液中包括多糖在內(nèi)的多種成分的濃度受到影響，通過測(cè)定大腸桿菌LB液體培養(yǎng)基上清液中總糖濃度的變化，可以間接確定細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)是否完整[13-15]。

由圖3可知，在加入艾草水提物之后，大腸桿菌培養(yǎng)物中的總糖濃度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在加入艾草水提物2.5 h之后大腸桿菌培養(yǎng)物總糖濃度達(dá)到最大值并基本維持穩(wěn)定，表明艾草水提取物使大腸桿菌細(xì)胞膜遭到破壞，菌體內(nèi)容物流出導(dǎo)致培養(yǎng)物中糖類含量升高。同時(shí)對(duì)照組培養(yǎng)物中總糖濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在逐漸降低，這說明大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖正在不斷消耗培養(yǎng)物中的糖類。此結(jié)果與“2.5”試驗(yàn)中電導(dǎo)率的結(jié)果一致。

2.7 ?經(jīng)濃縮液處理后上清液蛋白質(zhì)含量的變化

由圖4可知，當(dāng)加入艾草水提物后，培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)含量有所升高，表明艾草水提物可使大腸桿菌中的蛋白質(zhì)流出，綜合前期試驗(yàn)可知由于艾草水提物的作用導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞膜破損，細(xì)胞內(nèi)容物流出導(dǎo)致培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)含量升高。同時(shí)對(duì)照組由于大腸桿菌的消耗導(dǎo)致培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)含量有所降低。

3 ?小結(jié)

通過檢測(cè)艾草水提物加入大腸桿菌菌懸液后培養(yǎng)液電導(dǎo)率、總糖濃度、可溶性蛋白濃度的變化，得出以下結(jié)論：

1）艾草水提取物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖有明顯的抑制作用，且作用穩(wěn)定，可長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮作用，其最低抑制濃度為0.094 g/mL。

2）經(jīng)過艾草水提取物處理的大腸桿菌隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)均有胞質(zhì)滲漏，且胞質(zhì)滲漏速度不斷加快，在加入抑菌物質(zhì)2.5 h后導(dǎo)致大部分菌體細(xì)胞破損。試驗(yàn)結(jié)果說明艾草水提取物的抑菌性能穩(wěn)定，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到抑菌目的。艾草水提取物加入大腸桿菌菌懸液后可使其培養(yǎng)物凈電導(dǎo)率（去除艾草水提取物本身對(duì)電導(dǎo)率的影響）上升，且在加入艾草水提取物2.5 h后電導(dǎo)率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，可見其發(fā)揮作用的速度較快。

3）艾草水提取物使大腸桿菌細(xì)胞膜遭到破壞，菌體內(nèi)容物流出導(dǎo)致培養(yǎng)物中糖類、可溶性蛋白質(zhì)含量升高;同時(shí)對(duì)照組培養(yǎng)物中總糖和蛋白質(zhì)濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在逐漸降低，這說明大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖正在不斷消耗培養(yǎng)物中的糖類和蛋白質(zhì)。同樣在加入艾草水提取物2.5 h后總糖和可溶性蛋白質(zhì)濃度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此結(jié)果與培養(yǎng)液中電導(dǎo)率變化一致。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)論可知，艾草水提取物可導(dǎo)致大腸桿菌培養(yǎng)物的電導(dǎo)率、總糖濃度、總蛋白濃度上升，其主要機(jī)理為艾草水提取物可破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流出，從而影響培養(yǎng)物相關(guān)的生理生化指標(biāo)。其中電導(dǎo)率和總糖濃度的變化在2.5 h內(nèi)即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，其作用效率較高且性能穩(wěn)定。因此，艾草作為一種常見的中草藥，在抑菌方面有很大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

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