神經(jīng)疾病診斷與研究中的神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)

都展宏　魯藝　王立平

摘?要?神經(jīng)遞質(zhì)的在體檢測(cè)不僅可能作為帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、抑郁癥等多種神經(jīng)疾病的生物標(biāo)記物，同時(shí)，這類傳感器也可作為研究獎(jiǎng)賞、成癮、厭惡等多種行為產(chǎn)生機(jī)制的重要工具。近年來，多種檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的分析技術(shù)已得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，但目前應(yīng)用于疾病研究和在體檢測(cè)的傳感技術(shù)與材料尚面臨一些困難，只有較少的應(yīng)用實(shí)例。本文主要介紹了癲癇、帕金森氏癥、腦卒中、阿爾茲海默癥、精神分裂等疾病中神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮的重要作用及其檢測(cè)的科學(xué)意義，探討了在體傳感器技術(shù)的進(jìn)展，以及可能用于解析疾病神經(jīng)環(huán)路機(jī)制的相關(guān)技術(shù)和器件，重點(diǎn)探討了多種納米材料、導(dǎo)電聚合物材料和生物分子作為在體傳感器組成成分的應(yīng)用技術(shù)，以及未來這些新技術(shù)、新材料面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵詞?神經(jīng)遞質(zhì); 生物傳感器; 納米材料; 成像技術(shù); 疾病診斷; 評(píng)述

1?引 言

神經(jīng)遞質(zhì)是體內(nèi)負(fù)責(zé)在神經(jīng)元與其它細(xì)胞類型間傳遞或調(diào)控特定信號(hào)的化學(xué)分子。常見的神經(jīng)遞質(zhì)分子包括谷氨酸、γ?氨基丁酸、多巴胺、乙酰膽堿、腎上腺素、血清素、去甲腎上腺素和一氧化氮等[1]。神經(jīng)遞質(zhì)分子在行為與認(rèn)知發(fā)生等腦功能中都發(fā)揮著重要作用; 同時(shí)，它們?cè)谡{(diào)控心率、學(xué)習(xí)記憶、睡眠、覺醒、意識(shí)、情緒和食欲等方面具有重要意義。以谷氨酸為例，它是大腦最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)記憶、大腦發(fā)育、情緒情感調(diào)節(jié)等過程中都發(fā)揮了重要作用。谷氨酸能神經(jīng)元的異常也與多種疾病相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病和精神類疾病等[2]。本文重點(diǎn)介紹了一些重要神經(jīng)遞質(zhì)分子在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制，如圖1所示[3～9]。本文還介紹了神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)和器件、目前用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的環(huán)路研究機(jī)制、為滿足疾病診療需求開發(fā)的相關(guān)技術(shù)，以及為遞質(zhì)傳感器界面開發(fā)的多種類別的電極材料。最后，簡(jiǎn)要介紹了這些遞質(zhì)傳感技術(shù)在疾病與神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用中面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

2?神經(jīng)遞質(zhì)在腦功能與神經(jīng)疾病中的作用

各種神經(jīng)遞質(zhì)分子在神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)中各自發(fā)揮著不同的作用，并且很多神經(jīng)疾病都以一種或數(shù)種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的突觸傳遞發(fā)生改變?yōu)樘卣?。神?jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)既可幫助研究者更好地理解這種遞質(zhì)在生理和病理方面的作用，又可有效地驗(yàn)證針對(duì)特定神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的治療方法與某些特定的療效或行為改變的相關(guān)性。 以下對(duì)5種高發(fā)的神經(jīng)疾病及其密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能異常做簡(jiǎn)要介紹，這些病理神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)有可能成為神經(jīng)遞質(zhì)傳感器重要的在體應(yīng)用研究方向。

2.1?癲癇

大腦中最普遍的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和最普遍的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ?氨基丁酸在多數(shù)腦區(qū)和核團(tuán)中都普遍存在，也介導(dǎo)了多數(shù)長(zhǎng)程神經(jīng)投射的功能，而谷氨酸與γ?氨基丁酸對(duì)神經(jīng)功能的作用最直接、最顯著，其中研究最多的疾病就是癲癇。在患者大腦中，一些細(xì)胞集群活動(dòng)的增強(qiáng)和同步可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作，并且，有些細(xì)胞亞群可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性的爆發(fā)性發(fā)放狀態(tài)，這些機(jī)制的產(chǎn)生可能與γ?氨基丁酸、谷氨酸作用機(jī)制密切相關(guān)，特別是NMDA受體介導(dǎo)的興奮性谷氨酸電流[10，11]。這些興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在癲癇疾病發(fā)作中的異常，特別是其與癲癇起始、持續(xù)放電和傳播之間的關(guān)系已有大量的經(jīng)典研究支持[12～14]。然而，這種過度的興奮性發(fā)放究竟是由于γ?氨基丁酸能神經(jīng)元死亡而導(dǎo)致的抑制性活動(dòng)減弱，還是由于γ?氨基丁酸本身釋放減少或者受體減少導(dǎo)致突觸傳遞功能減弱，目前仍然不清楚。

在腦內(nèi)直接給予谷氨酸或者其受體激動(dòng)劑（如N?甲基?D?天冬氨酸（N?methyl?D?aspartate，NMDA））即可直接誘發(fā)癲癇。并且，大多數(shù)神經(jīng)元的谷氨酸濃度可達(dá)到10 mmol/L，遠(yuǎn)高于其它興奮性遞質(zhì)的濃度。一旦神經(jīng)細(xì)胞受損，胞內(nèi)谷氨酸就會(huì)泄漏出來，而胞外普遍存在谷氨酸受體。另外，一旦神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病變，如腦中的瘢痕組織、腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)，以及其它產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞病變的情況，都很可能損傷胞外的高效率谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)重吸收系統(tǒng)[15]，這些系統(tǒng)能穩(wěn)定地將胞外的谷氨酸濃度維持在5 mmol/L以下，最多不超過10 mmol/L。

相關(guān)研究表明，在癲癇灶點(diǎn)位置γ?氨基丁酸可使神經(jīng)元或神經(jīng)末梢有一定的損傷[16，17]，但也有人體組織研究表明，患者海馬體內(nèi)γ?氨基丁酸神經(jīng)元的群體未見變化[18]。動(dòng)物模型中，點(diǎn)燃癲癇模型的大鼠杏仁核內(nèi)γ?氨基丁酸能神經(jīng)元或神經(jīng)末梢顯著下降（約30%～50%），杏仁核內(nèi)γ?氨基丁酸的濃度也觀測(cè)到類似比例的下降[19，20]。作為顳葉癲癇密切相關(guān)的腦區(qū)，海馬與杏仁核的遞質(zhì)系統(tǒng)病變對(duì)于癲癇研究有重要的指示作用。有研究表明，在人體顳葉癲癇灶點(diǎn)位置手術(shù)切除的組織中，用神經(jīng)化學(xué)檢測(cè)的方式可測(cè)得γ?氨基丁酸能突觸傳遞明顯下降[21，22]，然而現(xiàn)有研究未能證實(shí)該結(jié)果[18]。有研究證明，點(diǎn)燃癲癇模型大鼠的杏仁核胞外微透析實(shí)驗(yàn)測(cè)得的γ?氨基丁酸濃度顯著下降了60%～70% [23]，一定程度上反映了癲癇動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中γ?氨基丁酸的合成明顯降低。針對(duì)興奮/抑制遞質(zhì)系統(tǒng)失衡的特點(diǎn)，長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)和研究表明，采用可影響胞外γ?氨基丁酸代謝的藥物增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的γ?氨基丁酸濃度， 可作為抑制癲癇的手段，但通過谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase， GAD）抑制劑降低γ?氨基丁酸濃度， 則會(huì)導(dǎo)致癲癇發(fā)生。

2.2?帕金森氏癥

帕金森氏癥的病理特征中，最顯著的標(biāo)志是在所有向端腦腦區(qū)投射的多巴胺能神經(jīng)元突觸前化學(xué)遞質(zhì)的減少[24～26]。這種多巴胺能投射減弱的最主要原因是黑質(zhì)及其相關(guān)的黑質(zhì)旁核中的多巴胺能神經(jīng)元胞體減少。研究表明，密集投射到紋狀體、伏隔核、嗅覺腦區(qū)和邊緣皮層區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)纖維主要源自黑質(zhì)的致密區(qū)[27，28]。一旦以藥物抑制或物理?yè)p傷等方式破壞黑質(zhì)投射到基底神經(jīng)節(jié)的多巴胺能神經(jīng)元，基底神經(jīng)節(jié)的正常功能就會(huì)受到嚴(yán)重影響。無論在動(dòng)物模型， 還是人體中，這種紋狀體中多巴胺能投射的減少都介導(dǎo)了帕金森氏癥中的主要癥狀（運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫）。在帕金森氏癥患者腦內(nèi)的黑質(zhì)、尾狀核、殼核、蒼白球等腦區(qū)中，無論是多巴胺濃度， 還是其代謝產(chǎn)物（高香草酸）的濃度，都明顯減少[29～31]。在原發(fā)性帕金森氏癥中，整體多巴胺損傷程度略輕，并且殼核受損比尾狀核嚴(yán)重[29]; 而在腦炎性帕金森病癥中，多巴胺能投射均有相對(duì)均勻的嚴(yán)重?fù)p傷。這種差異的主要原因?yàn)槟X炎型帕金森氏癥中，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元受到普遍的嚴(yán)重?fù)p傷，而原發(fā)性帕金森氏癥中的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷相對(duì)較輕，且主要影響特定區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元胞體，如尾側(cè)黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元[29]，而這些神經(jīng)元主要投射到殼核中。因此，在多巴胺能投射豐富的腦區(qū)測(cè)定多巴胺濃度的空間分布對(duì)研究各種癥狀的環(huán)路機(jī)制和開發(fā)針對(duì)性診療工具都具有重要的作用。

2.3?腦卒中

腦卒中是另一大類發(fā)作率非常高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，谷氨酸興奮性毒性導(dǎo)致的皮層損傷是卒中最嚴(yán)重的后果之一[32]。 盡管卒中方面的基礎(chǔ)研究已取得了很多進(jìn)展，臨床上針對(duì)這種嚴(yán)重病情所做的各種治療和預(yù)防嘗試都還未能達(dá)到很好的效果。在腦缺血發(fā)生后，神經(jīng)元釋放的大量谷氨酸會(huì)激活多種突觸前和突觸后的谷氨酸受體，從而導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度上升，進(jìn)而導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生，線粒體功能異常，蛋白酶、磷酸酯酶、限制性內(nèi)切酶等多種酶的激活，從而造成細(xì)胞死亡。同時(shí)，腦缺血發(fā)生后，興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Excitatory amino acid transporter 1，EAAT1）和EAAT2均有明顯損失，造成了胞外谷氨酸濃度升高，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[33～35]。另一種重要的細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的乳酸中毒非常敏感[36]，直接導(dǎo)致它們?cè)谒嵝原h(huán)境無法維持三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）產(chǎn)生[37]。ATP濃度下降進(jìn)一步導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的跨膜離子濃度梯度無法維持，鈉鉀離子ATP酶的活性被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致Na+內(nèi)流，胞內(nèi)Na+濃度升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)的谷氨酸由于其轉(zhuǎn)運(yùn)受到Na+濃度的影響而被轉(zhuǎn)移到胞外[38]，相當(dāng)于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能被逆轉(zhuǎn)[39?41]。這一過程與神經(jīng)細(xì)胞的谷氨酸系統(tǒng)異常聯(lián)合將導(dǎo)致胞外谷氨酸濃度進(jìn)一步升高。因此，在相對(duì)溫和的腦缺血狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體將一些谷氨酸轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)，但在嚴(yán)重缺血狀態(tài)下， 星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)起反作用，進(jìn)一步加劇毒性[42]。在腦缺血的過程中，大腦白質(zhì)中的細(xì)胞會(huì)受到嚴(yán)重影響，少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們產(chǎn)生的髓鞘會(huì)受到興奮性毒性的嚴(yán)重影響[43～47]，而白質(zhì)中的軸突則會(huì)由于胞內(nèi)Ca2+濃度劇烈升高導(dǎo)致的毒性而嚴(yán)重受損[48～50]。

2.4?阿爾茲海默癥

關(guān)于阿爾茲海默癥的理論已有多方面的研究，其中一種與神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能異常密切相關(guān)的神經(jīng)毒性理論認(rèn)為，當(dāng)局部谷氨酸濃度過高時(shí)，會(huì)對(duì)腦組織產(chǎn)生毒性[51]。一種假說認(rèn)為，谷氨酸興奮性毒性會(huì)激活代謝型谷氨酸受體及下游的一系列分子通路，導(dǎo)致阿爾茲海默癥的發(fā)生。同時(shí)，這些通路也被認(rèn)為是可能的藥物治療靶點(diǎn)，因此，針對(duì)代謝型谷氨酸受體的調(diào)控通路，研究者也在開發(fā)多種阿爾茲海默癥的潛在治療藥物[52]。這些受體下游有大量復(fù)雜的G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)通路，因此可能的調(diào)控干預(yù)方式也存在各種差別。另一種對(duì)阿爾茲海默癥十分重要的神經(jīng)遞質(zhì)分子乙酰膽堿不僅在大腦中發(fā)揮重要的作用，也在脊髓和其它組織中調(diào)控多種重要功能。 分泌乙酰膽堿的神經(jīng)元被稱為膽堿能受體， 而乙酰膽堿在認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)等多個(gè)功能的執(zhí)行中都有不可替代的作用。近年，針對(duì)谷氨酸和乙酰膽堿等遞質(zhì)開發(fā)了一系列基于酶反應(yīng)的體內(nèi)及體外生物傳感器系統(tǒng)[53]。而主流的研究認(rèn)為，腦內(nèi)乙酰膽堿含量增多與阿爾茲海默癥的癥狀改善密切相關(guān)，因而多種乙酰膽堿和谷氨酸傳感器均有可能在阿爾茲海默癥相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。

2.5?精神分裂癥

一種重要的精神分裂癥成因假說是谷氨酸能神經(jīng)元的功能弱化導(dǎo)致該病發(fā)生[54]。在患者腦脊液中測(cè)得的谷氨酸濃度降低及谷氨酸拮抗劑可導(dǎo)致部分癥狀產(chǎn)生的現(xiàn)象均可在一定程度證明該假說。特別是鹽酸苯環(huán)己哌啶的使用可誘導(dǎo)一種類似于精神分裂癥的疾病狀態(tài)， 使得該假說被相對(duì)廣泛地接受[55，56]。另一方面，苯環(huán)己哌啶及類似物（如鹽酸氯胺酮和地卓西平馬來酸鹽）均可通過結(jié)合谷氨酸的NMDA受體而非競(jìng)爭(zhēng)性抑制該受體作用，從而誘導(dǎo)精神分裂癥的行為學(xué)表征[57]。

一些研究也證實(shí)了精神分裂癥患者腦中的谷氨酸能系統(tǒng)異常。在精神分裂癥患者大腦皮層組織中， 突觸小體中谷氨酸釋放明顯缺陷，而使用氟哌啶醇預(yù)處理這些組織可部分逆轉(zhuǎn)該作用[58]; 同時(shí)，精神分裂癥患者前額葉皮層中，谷氨酸再吸收和海人酸受體的結(jié)合均增強(qiáng)[59， 60]，一定程度上反映了患者谷氨酸突觸傳遞活動(dòng)的降低。相比之下，患者的殼核、海馬體及旁海馬皮質(zhì)中的海人酸受體結(jié)合有一定程度降低[61，62]，在基底神經(jīng)節(jié)中谷氨酸的重吸收[63]和NMDA受體的表達(dá)[64]也有一定程度的降低。這些研究充分證明了谷氨酸傳遞在精神分裂癥患者大腦中發(fā)揮了重要作用，且病理下谷氨酸系統(tǒng)的增強(qiáng)和減弱也有強(qiáng)烈的腦區(qū)特異性。

3?神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的技術(shù)和器件

目前， 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的技術(shù)和元器件開發(fā)已得到了多方面發(fā)展[51， 65～69]。在檢測(cè)遞質(zhì)的電化學(xué)方法中，采用伏安法可測(cè)定多種自身具有氧化還原特性的神經(jīng)遞質(zhì)，典型的包括多巴胺、去甲腎上腺素、血清素等; 通過酶在電極表面與遞質(zhì)發(fā)生反應(yīng)并用電化學(xué)方法檢測(cè)該過程的酶?jìng)鞲衅饕驳玫搅硕喾N應(yīng)用，包括谷氨酸、乙酰膽堿等遞質(zhì)的檢測(cè); 而為了在各種生物實(shí)驗(yàn)設(shè)定下得到腦組織內(nèi)遞質(zhì)濃度分布的空間信息，細(xì)胞表達(dá)的熒光探針結(jié)合成像技術(shù)也已可探測(cè)多種神經(jīng)遞質(zhì)分子; 綜合考慮檢測(cè)的時(shí)間分辨率、樣品使用量、電極生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性等方面的需求，進(jìn)一步使用微流控器件和場(chǎng)效應(yīng)管（Field effect transistor，F(xiàn)ET）等器件的開發(fā)也已取得了多方面應(yīng)用。本節(jié)將就這些方面分別舉例說明神經(jīng)遞質(zhì)分子檢測(cè)技術(shù)和器件的研究展。

3.1?伏安法測(cè)定遞質(zhì)濃度

在多種電化學(xué)技術(shù)中，快速循環(huán)伏安法（Fast scan cyclic voltammetry， FSCV）被用于神經(jīng)遞質(zhì)分子監(jiān)測(cè)，也是在體神經(jīng)遞質(zhì)濃度監(jiān)測(cè)較成熟的技術(shù)。這種技術(shù)可在單個(gè)位點(diǎn)上準(zhǔn)確測(cè)量一些種類神經(jīng)遞質(zhì)分子的濃度變化，并且時(shí)空精度高于微透析等測(cè)量方式。除FSCV外，差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry， DPV）和方波伏安法（Square wave voltammetry， SWV）等方法在遞質(zhì)檢測(cè)中也發(fā)揮了重要作用。關(guān)于FSCV測(cè)定遞質(zhì)濃度的生物傳感器已有大量研究報(bào)道，且多數(shù)FSCV方法采用碳纖維電極[70]。同時(shí)，近期還有一些研究基于新材料的循環(huán)伏安法測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)濃度，如一種免疫傳感器表面采用了多巴胺單克隆抗體修飾的磁性納米顆粒[10]。在磁性納米顆粒的表面附著了碳納米管（Carbon nanotubes， CNTs），將這種復(fù)合物顆粒通過磁力吸附在金電極的表面上，可采用循環(huán)伏安法測(cè)定多巴胺的濃度，測(cè)定范圍可達(dá)到780 pmol/L～50 mmol/L，檢測(cè)限（Limit of detection， LOD）可達(dá)到120 nmol/L。另一項(xiàng)研究中，通過碳纖維電極測(cè)定血小板懸浮液分泌的血清素[71]，采用了FSCV方法，可得到較好的時(shí)間分辨率和靈敏度，并且可通過循環(huán)伏安法針對(duì)性研究血清素的氧化還原特性。近期開發(fā)的一種無線傳輸?shù)膶?shí)時(shí)電化學(xué)傳感器也可通過FSCV方法測(cè)定血清素的濃度[72]，該研究使用的1000 V/s的N型快速線性掃描電流（+0.2 V到0.1 V，再到+0.2 V）可在背側(cè)中縫核的腦片上檢測(cè)電刺激誘發(fā)釋放的血清素濃度，這種傳感器可檢測(cè)到10 mmol/L的血清素。

除FSCV外，還有多種伏安法可用于生物傳感器。如血清素傳感器利用分子與配體相互作用的檢測(cè)方式，采用金電極表面的自組裝巰甲丙脯氨酸和苯硫醇單分子層[73]。血清素分子可被選擇性強(qiáng)吸附在電極表面，從而檢測(cè)到陽極溶出電流或觀察到氧化還原探針的電荷轉(zhuǎn)移電阻升高。此研究中差分脈沖陽極溶出伏安法和電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)血清素的LOD可分別達(dá)到28 nmol/L和1.2 nmol/L。

3.2?酶?jìng)鞲衅?/p>

如圖2A所示，采用計(jì)時(shí)電流法的酶?jìng)鞲衅骺蓽y(cè)定谷氨酸等多種分子的濃度[74]， 但酶的制備且活性易損， 也有研究者以如圖2B中的核酸適配體制備無酶?jìng)鞲衅鱗75]。 又如在金電極表面修飾谷氨酸氧化酶（Glutamate oxidase，GluOx）、羧基化多壁碳納米管（Carboxylated multi?walled carbon nanotubes， COOH?MWCNTs）、金納米顆粒和殼聚糖的電極。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種電極可在5～500 mmol/L范圍內(nèi)測(cè)定谷氨酸的濃度，LOD可達(dá)到1.6 mmol/L[76]。多種基于膽堿氧化酶、膽堿酯酶的乙酰膽堿生物傳感器也可用于快速測(cè)定乙酰膽堿的濃度[77]，這種傳感器常將酶固定在各種膜層材料或固相表面上，采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定乙酰膽堿的濃度。另一種膽堿和乙酰膽堿的酶?jìng)鞲衅鞑捎昧颂祭w維表面電聚合的聚鄰苯二胺膜層[78]，同時(shí)在膜層固定乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶，隨后沉積的是CNT和萘酚膜。這種計(jì)時(shí)電流法傳感器可檢測(cè)膽堿和乙酰膽堿的濃度，LOD可達(dá)45 nmol/L。為了提高傳感器的靈敏度，酶?jìng)鞲衅餍枰_(dá)到近似于單分子層的覆蓋條件[79]。降低膜層的厚度可有效地提高酶?jìng)鞲衅鞯臅r(shí)間精度，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可有效地降低檢測(cè)對(duì)象分子擴(kuò)散到達(dá)酶層的時(shí)間。這項(xiàng)研究中，納米薄層石墨烯修飾的碳纖維電極表面以摩爾比1∶10固定了膽堿酯酶和膽堿氧化酶，這樣可達(dá)到最佳的酶反應(yīng)效率。計(jì)時(shí)電流法可在10 μmol/L～4 mmol/L范圍內(nèi)線性檢測(cè)乙酰膽堿濃度，LOD為10 μmol/L。另一種基于14～70 nm微管結(jié)構(gòu)的乙酰膽堿傳感器，可采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定250 μmol/L～6 mmol/L的乙酰膽堿濃度[80]，其LOD為205 μmol/L。

盡管循環(huán)伏安法已被成功用于各種在體和離體的多巴胺濃度測(cè)定，也有研究通過在碳纖維電極表面交聯(lián)固定的酪氨酸酶開發(fā)針對(duì)多巴胺檢測(cè)的酶?jìng)鞲衅鱗81]。在反應(yīng)中，酪氨酸酶可催化多巴胺和o?多巴醌的轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)電流法測(cè)定多巴胺濃度， 在10 nmol/L～220 mmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LOD為1 nmol/L。

3.3?在體分子遺傳熒光探針

光學(xué)成像神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)是一種可通過檢測(cè)遞質(zhì)與熒光探針結(jié)合發(fā)光強(qiáng)弱變化測(cè)定分子濃度的方法[82]，圖2C顯示了一種谷氨酸熒光探針的原理[82]。與微透析、電流記錄、電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，這是一種相對(duì)無創(chuàng)且高通量的檢測(cè)方式。為了通過光學(xué)成像方法檢測(cè)某種神經(jīng)遞質(zhì)分子的動(dòng)態(tài)變化，這種檢測(cè)熒光蛋白需要滿足以下條件：必須直接、特異地與目標(biāo)分子發(fā)生結(jié)合，并導(dǎo)致蛋白構(gòu)型的改變; 熒光強(qiáng)度必須隨著這種蛋白構(gòu)型的改變而發(fā)生變化。

目前，已開發(fā)的具有一定代表性的遞質(zhì)分子熒光探針已可在多種性能方面實(shí)現(xiàn)相對(duì)較好的遞質(zhì)濃度檢測(cè)，如γ?氨基丁酸熒光探針傳感器。γ?氨基丁酸?Snifit的Kd=100 μmol/L，熒光強(qiáng)度變化（ΔF/F0）可達(dá)到0.5，時(shí)間常數(shù)Ton=1.5 s，Toff=2.8 s[83]; 谷氨酸熒光探針傳感器iGluSnFR的Kd=4.9 μmol/L， 熒光強(qiáng)度變化可達(dá)到1.03，時(shí)間常數(shù)為92 ms[8]; 多巴胺熒光探針傳感器D2?CNiFER的Kd=2.5 nmol/L， 熒光強(qiáng)度變化可達(dá)到0.57，時(shí)間常數(shù)小于7 s[84]; 乙酰膽堿熒光探針傳感器GACh的Kd=0.78 μmol/L，熒光強(qiáng)度變化可達(dá)到0.9，時(shí)間常數(shù)為280 ms[85]; 去甲腎上腺素?zé)晒馓结槀鞲衅鱝2AAR?cam的Kd=17 nmol/L，熒光強(qiáng)度變化可達(dá)到

0.05，時(shí)間常數(shù)為40 ms[86]。

總之，盡管很多種神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針仍然在信噪比和時(shí)間精度方面仍有一定局限性，但這些可通過遺傳操作表達(dá)的神經(jīng)遞質(zhì)傳感器可提供較好的分子選擇性、空間精度和細(xì)胞特異性，而對(duì)于在體研究，這些屬性均具有重要作用。

3.4?微流控器件

微流控器件在充分發(fā)揮電極材料優(yōu)勢(shì)并可重復(fù)生產(chǎn)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此在近年受到越來越多的重視。NO在調(diào)控突觸傳遞方面發(fā)揮著重要作用，通過在金/氧化銦錫電極表面沉積一層催化NO轉(zhuǎn)化成N2的鐵氰化物鍍層作為工作電極而構(gòu)建的微流控裝置，可用于測(cè)定NO的濃度，進(jìn)一步通過透氣膜層增加傳感器對(duì)NO的選擇性，這種傳感器對(duì)NO的LOD可達(dá)到1 nmol/L[87]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗壞血酸可有效地對(duì)抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，并且星型膠質(zhì)細(xì)胞可通過抗壞血酸和谷氨酸分子的胞內(nèi)外跨膜交換而實(shí)現(xiàn)降低胞外谷氨酸濃度[88，89]。針對(duì)在體抗壞血酸濃度的檢測(cè)，一種單通道的微流控期間可達(dá)到很好的檢測(cè)效果[90]。這種方法采用了氧化銦錫玻璃上修飾CNT的方式制備工作電極，從而促進(jìn)抗壞血酸在電極表面的氧化。通過這種技術(shù)觀察到，在腦缺血的過程中， 抗壞血酸濃度的逐漸降低; 而在腦缺血再灌注過程中， 抗壞血酸濃度明顯升高。另外，由于Mg2+可通過阻斷鈣通道的方式對(duì)NMDA受體發(fā)揮重要的調(diào)控作用[91～93]，針對(duì)抗壞血酸和Mg2+實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)的新型微流控器件技術(shù)可能在谷氨酸能傳導(dǎo)的研究中發(fā)揮起到重要作用。

通過光蝕刻技術(shù)制備的微流控芯片通常具有靈敏度高、快速響應(yīng)、檢測(cè)限低且線性檢測(cè)范圍較好的優(yōu)勢(shì)， 可應(yīng)用于生物傳感器[73]。如一種基于計(jì)時(shí)電流法的雙電極微流控芯片， 采用在芯片上固定乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的方式檢測(cè)乙酰膽堿的濃度， 在優(yōu)化的基底材料上分別固定這兩種酶， 制成的傳感器可提供更寬的動(dòng)態(tài)區(qū)間，更低的檢測(cè)限及優(yōu)良的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，因此可提高乙酰膽堿傳感器的檢測(cè)效率[94]。

3.5?場(chǎng)效應(yīng)管傳感器

由于神經(jīng)遞質(zhì)的釋放通常發(fā)生在毫秒量級(jí)，基于場(chǎng)效應(yīng)管的快速生物傳感器可在研究中起到獨(dú)特的重要作用，因而這些場(chǎng)效應(yīng)管傳感器在生物傳感器領(lǐng)域也逐漸引起關(guān)注，如一種SWCNT場(chǎng)效應(yīng)管傳感器采用了表達(dá)m型乙酰膽堿受體的大腸桿菌修飾，這樣可提高乙酰膽堿檢測(cè)的靈敏性和選擇性。這種傳感器對(duì)乙酰膽堿的LOD可達(dá)到100 pmol/L[95]。

另外一項(xiàng)研究中，使用多晶硅線場(chǎng)效應(yīng)管制成的多巴胺傳感器，可在fmol/L級(jí)別檢測(cè)多巴胺的濃度，并且這種傳感器的制備可通過現(xiàn)有的商用半導(dǎo)體制造技術(shù)實(shí)現(xiàn)，因此可能迅速實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定生產(chǎn)[96]。

4?神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的電極材料

很多種新型電極材料已被用于制作檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的生物傳感器，不同材料在各種遞質(zhì)的檢測(cè)中發(fā)揮各自的獨(dú)特作用。其中，金屬納米結(jié)構(gòu)材料可通過模仿酶活性中心的方式， 實(shí)現(xiàn)遞質(zhì)的無酶檢測(cè)，而核酸適體材料則可通過測(cè)定構(gòu)像改變后氧化還原電流的變化或電極阻抗變化的方式實(shí)現(xiàn)遞質(zhì)的無酶檢測(cè)。這些不依賴電極表面固定酶的生物傳感器材料既可解決酶作為蛋白質(zhì)可能變性失活的問題，又可大幅度降低傳感器的制作成本，從而方便技術(shù)的推廣應(yīng)用。但體外傳感器技術(shù)取得的檢測(cè)效果在轉(zhuǎn)移到體內(nèi)應(yīng)用時(shí)都面臨多種問題，如電極表面的細(xì)胞和蛋白質(zhì)生物污損更加復(fù)雜多樣等。

4.1?碳納米管和石墨烯

采用在電極表面鍍導(dǎo)電膜層的方式可一定程度上改進(jìn)對(duì)多巴胺的檢測(cè)性能[97]。例如，帶正電的多巴胺分子和帶負(fù)電的卟啉修飾石墨烯電極間可通過分子間芳環(huán)作用和靜電力加速電子轉(zhuǎn)移，圖3A展示了石墨烯分子的常見結(jié)構(gòu)形態(tài)。相比之下，帶負(fù)電的干擾分子（如抗壞血酸和尿酸分子）可被帶負(fù)電的卟啉電極表面抑制，這種電極對(duì)多巴胺的檢測(cè)LOD可達(dá)到10 nmol/L。 Prasad等[98]以整合了CNT的聚合材料網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成中的腎上腺素分子作為模板分子，在石墨電極表面使用這種復(fù)合材料制成分子印跡傳感器電極，采用差分脈沖陽極溶出伏安法（Differential pulse anodic stripping voltammetry， DPASV）測(cè)定腎上腺素的濃度，線性范圍在0.5～32 nmol/L之間， LOD可達(dá)到10.9 nmol/L。

在血清素檢測(cè)方面， 碳納米材料也有多種應(yīng)用。例如， Sun等[99]采用CNT和離子液體的復(fù)合電極材料，可同時(shí)檢測(cè)血清中的血清素和多巴胺的濃度，血清素的LOD可低至8 nmol/L。然而， 由于多種生物組織液中都普遍存在尿酸， 而尿酸在這種電極上的干擾信號(hào)可達(dá)到10倍以上，因此限制了其應(yīng)用。Han等[100]在卟啉修飾的玻碳電極上采用還原的氧化石墨烯材料檢測(cè)血清素， LOD可低至4.9 nmol/L。 但由于缺乏實(shí)際樣品的測(cè)試，尚不確定該電極是否可能用于臨床樣本檢測(cè)。由于低阻抗和大的反應(yīng)面積， 碳納米管在多種遞質(zhì)的檢測(cè)中均已展現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，圖3B展示了一種MWCNT修飾的電極可實(shí)現(xiàn)的大比表面積多孔三維結(jié)構(gòu)[101]。Goyal等[102]采用MWCNT修飾電極，基于方波脈沖法測(cè)定了吸煙人群血液中的腎上腺素，相較于未修飾的電極， MWCNT修飾電極可對(duì)腎上腺素氧化發(fā)揮催化活性， 進(jìn)而升高電流并降低氧化電位， LOD可達(dá)到0.15nmol/L。

Xiang等[103]基于在碳纖維表面垂直排布的CNT陣列檢測(cè)了大鼠腦中抗壞血酸的濃度; 并通過在這些CNT陣列表面沉積鉑層的方法，制備了可檢測(cè)腦缺血/再灌注過程中氧氣濃度變化的傳感器[104]。

4.2?金屬納米鍍層和納米顆粒

大量研究證明， 在電極表面合成和沉積金屬納米材料是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的提高生物傳感器性能的方式[105，106]。 垂直排列的鎳納米線和鍍鉑鎳納米線修飾的電極可在不依賴酶的條件下實(shí)現(xiàn)谷氨酸濃度的電化學(xué)檢測(cè)。這些檢測(cè)電極總體檢測(cè)較靈敏并且比酶電極成本低，利于推廣（圖3C）[107]。研究表明，這種材料制成的電極可檢測(cè)濃度低于8 mmol/L的谷氨酸，而鎳納米線和鍍鉑鎳納米線修飾電極的LOD可分別達(dá)到68和83 μmol/L[108]。

另一種方式是基于仿生的原理， 通過金屬材料實(shí)現(xiàn)類似酶催化作用的電極材料[109]，因?yàn)槎喾N酶的催化中心都通過不同的金屬離子實(shí)現(xiàn)催化作用，如使用銅離子復(fù)合物和銀納米顆粒修飾的玻碳電極可制備多巴胺傳感器。這種銅離子復(fù)合物材料可模仿酪氨酸酶的循環(huán)催化作用，特別是用雙氧水預(yù)處理電極的條件下可提高多巴胺檢測(cè)的峰電流值，從而提高檢測(cè)性能。另外，金屬納米顆粒在遞質(zhì)傳感器中也有重要的應(yīng)用，圖3D展示了一種金納米顆粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[76]， 這種納米顆粒制成都的復(fù)合材料可有效檢測(cè)谷氨酸濃度。研究發(fā)現(xiàn)，銀納米顆粒對(duì)多巴胺的電催化效果遠(yuǎn)強(qiáng)于未修飾的普通金屬電極。而通過在玻碳電極表面修飾氧化鎳納米顆粒和CNT材料， 并采用針對(duì)腎上腺素的雙十六烷基磷酸鹽膜覆蓋的方式制備的傳感器也可通過差分脈沖伏安法測(cè)定腎上腺素的濃度[110]，檢測(cè)范圍為0.3～9.5 μmol/L， LOD可達(dá)到82 nmol/L。

4.3?核酸適體

如圖2B所示，除了使用酶檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的方法，也可用通過檢測(cè)核酸適體的構(gòu)像改變方式實(shí)現(xiàn)遞質(zhì)分子的檢測(cè)[12，111]。即如圖中展示的多巴胺核酸適體傳感器[75]。 針對(duì)各種神經(jīng)遞質(zhì)分子的核酸適體均可通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by exponential Enrichment，SELEX）過程篩選出來[112]，為傳感器的開發(fā)提供了便利條件。 人工合成的適體分子易于化學(xué)修飾，從而提高選擇性、響應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定性等多種性質(zhì)[113， 114]。通過適體5'端的巰基結(jié)合到金電極上，且在3'端結(jié)合亞甲基藍(lán)的方式，適體可在目標(biāo)分子存在的時(shí)候改變構(gòu)像從而拉近亞甲基藍(lán)分子和電極的距離，檢測(cè)電流變化即可測(cè)定目標(biāo)分子濃度[115]，圖中ET表示電子傳遞（Electron transfer）。此技術(shù)響應(yīng)時(shí)間為45～100 s，親和力可達(dá)微摩爾級(jí)， 并且可實(shí)現(xiàn)生理濃度下的分子檢測(cè)，而且該技術(shù)也被證實(shí)可在體檢測(cè)4.5 h以上。

Farjami等[116]通過計(jì)時(shí)電流法測(cè)定帶負(fù)電的核酸適體和帶正電的半胱氨酸修飾電極之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)多巴胺濃度的測(cè)定，檢測(cè)范圍為100 nmol/L～5 mmol/L，采用電極表面鍍萘酚膜的方式，抗壞血酸和尿酸的干擾均可基本排除。通過調(diào)控適體與電極表面結(jié)合的靜電力[74]，還可進(jìn)一步提高多巴胺分子的親和力，在最佳狀態(tài)下， 適體解離常數(shù)可達(dá)到（0.12±0.01 ）mmol/L。

然而， 核酸適體傳感器也面臨一些挑戰(zhàn)，由于缺乏穩(wěn)定的電極表面膜層， 可通過限制擴(kuò)散而篩選帶電大分子，這類電極通常不能用于測(cè)定大分子濃度。但這些傳感器通常都可以測(cè)定藥用小分子在特定組織內(nèi)的濃度。這些核酸適體有時(shí)會(huì)與不同的待測(cè)藥物分子反應(yīng)，但對(duì)于藥用分子濃度測(cè)定而言， 這些限制通常不是決定性因素，因?yàn)樵谝话闱闆r下， 這種藥物分子在體內(nèi)不存在結(jié)構(gòu)過度類似的分子，但這些傳感器測(cè)定神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性生物標(biāo)記物分子可能會(huì)遇到困難，因?yàn)樵诮M織內(nèi)部這些分子的代謝過程中常有結(jié)構(gòu)近似的分子，可能需要通過更多輪次的SELEX正向/負(fù)向選擇， 提高適體的特異性。另外，核酸適體等具備傳感功能的分子，由于其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與生物體本身的遺傳物質(zhì)DNA相同，可能受到體內(nèi)核酸內(nèi)切酶等多種酶的催化降解作用。

5?神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的局限與展望

目前，遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)受到了越來越多的重視，特別是與電生理和光遺傳等技術(shù)聯(lián)用的可能性吸引了神經(jīng)科學(xué)和工程材料領(lǐng)域的共同關(guān)注。目前，基于導(dǎo)電聚合物和CNT等修飾材料的電極已被成功用于在體電生理研究[9，108，117～120]，神經(jīng)電極修飾的COOH?CNT一方面可用于共價(jià)連接特定的修飾分子（如酶分子），從而實(shí)現(xiàn)在體傳感器的制備，也可用于快速循環(huán)伏安法測(cè)定多巴胺等遞質(zhì)[121]; 另一方面，一些柔性神經(jīng)電極材料也引起越來越多的關(guān)注[122]，而這些電極的聚合物導(dǎo)電尖端或者絕緣層也可能與在體電化學(xué)傳感器聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)慢性植入下生物相容性更好的電化學(xué)檢測(cè)。一些新型的神經(jīng)界面電極材料（如碳納米管束電極等）也可實(shí)現(xiàn)在體的分子檢測(cè)[123，124]。

然而，電生理和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)由于互相之間的電流滲漏而難以直接在系統(tǒng)中整合聯(lián)用，而開發(fā)異步分時(shí)采集電化學(xué)和電生理信號(hào)的技術(shù)相對(duì)易于實(shí)現(xiàn)[66]。一些實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，可在黑質(zhì)中進(jìn)行電生理記錄， 并在新紋狀體中采用電化學(xué)方法檢測(cè)下游的多巴胺濃度[125]。也有一些研究嘗試采用同一個(gè)電極陣列上不同位點(diǎn)分別采集電生理信號(hào)和電化學(xué)信號(hào)的方法，當(dāng)記錄位點(diǎn)距離為200 μm時(shí)，計(jì)時(shí)電流法對(duì)場(chǎng)電位和單神經(jīng)元活動(dòng)的影響較小[126]。

一些電化學(xué)修飾材料除了可降低神經(jīng)電極的阻抗，也可用于精準(zhǔn)控制藥物釋放 [127]，這項(xiàng)技術(shù)可與電化學(xué)傳感器聯(lián)用， 而實(shí)現(xiàn)對(duì)某種或某些神經(jīng)遞質(zhì)的閉環(huán)調(diào)控。 這種對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)閉環(huán)調(diào)控的概念逐漸受到研究者的重視[128]。

另一方面，光遺傳技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用日趨廣泛，如本能恐懼行為的皮層下通路[129， 130]與癲癇[131]、老年癡呆[132]等疾病的研究。目前，F(xiàn)SCV技術(shù)與光遺傳技術(shù)的結(jié)合已在社交孤立模型的環(huán)路機(jī)制研究等方面取得了一些重要進(jìn)展[133]。但光遺傳技術(shù)與在體傳感器的結(jié)合仍處于應(yīng)用早期，有廣闊的發(fā)展空間[134]。由于光遺傳技術(shù)使用的光纖也可用于在體熒光測(cè)定遞質(zhì)濃度，兩者的結(jié)合可能為局部環(huán)路的閉環(huán)遞質(zhì)濃度檢測(cè)與調(diào)控技術(shù)提供新的解決方案。 另外，由于光遺傳技術(shù)本身并不受電流的影響，因此光遺傳學(xué)調(diào)控神經(jīng)元活動(dòng)可與電化學(xué)遞質(zhì)濃度檢測(cè)結(jié)合起來，從而避免電生理方法等與電化學(xué)聯(lián)用檢測(cè)遞質(zhì)濃度過程中存在的各種障礙。

盡管面臨諸多機(jī)遇，但由于大腦的復(fù)雜性，在不破壞整體組織完整性的前提下檢測(cè)某種特定遞質(zhì)濃度，仍要面對(duì)多種干擾物分子同時(shí)游離在檢測(cè)電極周圍的復(fù)雜情況，因而在體傳感器也面臨著許多挑戰(zhàn)：（1）電極尺寸需足夠小，從而能在盡可能不破壞大腦本身組織結(jié)構(gòu)的情況下測(cè)定遞質(zhì)濃度，而小電極尺寸也為具有更高空間精度的遞質(zhì)檢測(cè)提供了可能; （2）在體遞質(zhì)傳感器必須滿足快速響應(yīng)和靈敏度高等特征，因而目前的各種技術(shù)均面臨一定挑戰(zhàn)，而高性能傳感器中，有的器件結(jié)構(gòu)復(fù)雜、精密度高，會(huì)影響成品的優(yōu)良率，且會(huì)提升在體應(yīng)用中喪失功能的風(fēng)險(xiǎn); （3）高選擇性對(duì)分析技術(shù)十分重要，但是體內(nèi)分子種類復(fù)雜多樣，因此生物傳感器檢測(cè)信號(hào)的解讀需格外慎重，多種在體檢測(cè)信號(hào)的聯(lián)用和交叉檢查可能提供更具參考性的信息，但可能顯著增加難度和開發(fā)周期; （4） 某些用于修飾的納米材料等對(duì)生物組織有潛在毒性，需謹(jǐn)慎考慮并測(cè)定這些因素的影響程度，特別是對(duì)潛在的在體應(yīng)用; （5）蛋白質(zhì)和細(xì)胞組織在電極表面的貼附會(huì)導(dǎo)致電極的生物污損或生物毒性效應(yīng)，特別是利用多肽和核酸適體等分子的電極材料需慎重考慮內(nèi)源性酶對(duì)這些分子的潛在降解，及其對(duì)傳感器在體壽命的影響。

通過遞質(zhì)傳感器技術(shù)的改進(jìn)、與其它神經(jīng)技術(shù)的聯(lián)用以及針對(duì)在體環(huán)境設(shè)計(jì)與測(cè)試等方面的方法學(xué)推進(jìn)，遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有望在闡明神經(jīng)系統(tǒng)中各種疾病發(fā)生的機(jī)制和提供針對(duì)性治療方案等方面發(fā)揮更重要的作用。

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