檢測β淀粉樣肽不同構(gòu)象的生物電化學(xué)傳感器的研究進(jìn)展

王健行　田夢　舒桐　蘇磊　劉國東　張學(xué)記

摘?要?阿爾茨海默癥是一種不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨年齡增長，發(fā)病率近似呈現(xiàn)指數(shù)式增高，因此受到廣泛關(guān)注。遏制阿爾茨海默癥在人群中的蔓延，當(dāng)前有效的方法是預(yù)防和早期診斷。目前，β淀粉樣肽是研究最廣且公認(rèn)的可用于阿爾茨海默病早期診斷的重要生物標(biāo)志物。近年來，電化學(xué)生物傳感方法由于其操作簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好和對β淀粉樣肽不同構(gòu)象的信號響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究者的廣泛關(guān)注。本文從β淀粉樣肽的生物識別單元的角度評述了近五年β淀粉樣肽單體、低聚物和纖維檢測的電化學(xué)生物傳感方法的研究進(jìn)展，并對該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?阿爾茨海默癥; 早期診斷; β淀粉樣肽; 電化學(xué)生物傳感器; 評述

1?引 言

阿爾茨海默癥是一種不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該疾病患者常伴有認(rèn)知衰退和記憶力喪失，嚴(yán)重時可發(fā)生運(yùn)動障礙，并逐步喪失自理能力[1～4]。隨年齡增長，阿爾茨海默癥發(fā)病率近似呈指數(shù)式增高。據(jù)估計(jì)，到2025年，全世界約有3400萬人罹患阿爾茨海默癥，并且，伴隨著如今日益加劇的世界人口老齡化趨勢，老齡人數(shù)將以每20年翻一番的速度增長[4]。遺憾的是，目前尚無有效的治療方法可延緩阿爾茨海默癥的發(fā)病及發(fā)展，而對于遏制阿爾茨海默癥在人群中的蔓延，當(dāng)前更加有效的方法是預(yù)防和早期診斷[5]。然而，在阿爾茨海默癥早期階段，其患者的認(rèn)知功能并無明顯衰退，在常規(guī)臨床檢查過程中面臨難確診、易耽誤有效醫(yī)治時機(jī)的嚴(yán)峻問題。近期大量的研究指出[6]，在血液或腦脊液等體液中存在可通過生物化學(xué)分析方法檢測到的、與阿爾茲海默癥早期階段有關(guān)的特殊生物物質(zhì)。這些生物物質(zhì)也稱為與阿爾茲海默癥相關(guān)的生物標(biāo)志物。目前，β淀粉樣肽（Aβ）是研究最廣且公認(rèn)的可用于阿爾茨海默病早期診斷的重要生物標(biāo)志物[7]。

Aβ單體由β?和γ?分泌酶水解淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生，通常由40或42個氨基酸（Aβ1-40或Aβ1-42）構(gòu)成[8，9]。Aβ1-40和Aβ1-42可自發(fā)聚集[10]，逐步形成可溶性Aβ低聚物和不可溶的Aβ纖維狀高聚物。Aβ纖維可進(jìn)一步形成不可溶的Aβ老年斑，即阿爾茨海默癥的主要病理特征之一[11]。與Aβ1-40相比，Aβ1-42的聚集速度更快，能對神經(jīng)細(xì)胞造成更大的自由基損傷，具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性，其聚集產(chǎn)生的Aβ纖維可通過誘導(dǎo)大腦中的免疫應(yīng)答，過度激活小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放大量神經(jīng)炎癥因子，長期累積后，對神經(jīng)造成有害的影響[11～13]。此外，有報(bào)道指出，與Aβ纖維相比，可溶性Aβ低聚物也可能具有更高的細(xì)胞毒性，可通過與突觸后膜的神經(jīng)元結(jié)合引發(fā)與阿爾茨海默癥相關(guān)的突觸功能障礙，是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性的主要Aβ構(gòu)象[14，15]。因此，上述3種Aβ構(gòu)象（Aβ單體、Aβ低聚體和Aβ纖維）均是早期診斷阿爾茨海默癥的重要生物標(biāo)志物。

目前，已發(fā)展出多種檢測不同Aβ構(gòu)象的技術(shù)手段，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）[16～18]、掃描隧道電子顯微鏡[19]、磁共振成像[20]、熒光成像[21]和電化學(xué)方法等。但是，這些方法大多操作復(fù)雜、耗時長且成本高。近年來，電化學(xué)生物傳感方法由于具有操作簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好和對不同Aβ構(gòu)象的信號響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究者的廣泛關(guān)注。電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建大多基于某些特定的、可特異性結(jié)合Aβ的生物小分子作為生物識別單元，如抗體、適配體、蛋白質(zhì)和肽等。本文從Aβ生物識別單元的角度，綜述了近五年Aβ單體、Aβ低聚物和Aβ纖維檢測的電化學(xué)生物傳感方法的研究進(jìn)展，并對該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

2?Aβ單體的檢測

2.1?抗體識別單元

基于抗體?抗原特異性結(jié)合的電化學(xué)免疫傳感器由于具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測Aβ單體的主要電化學(xué)傳感平臺。如利用可特異性識別Aβ40單體的抗體構(gòu)建電化學(xué)傳感器，可在Aβ40低聚物、Aβ40纖維和Aβ40單體存在時選擇性地檢測Aβ40單體。最近，Xiang研究組利用Aβ40單體及其抗體構(gòu)建了多種電化學(xué)傳感器[22～24]。根據(jù)報(bào)道，在修飾有Aβ40單體抗體的納米金顆粒與電極表面間增加通過靜電力誘導(dǎo)的雙鏈DNA的彈性縮合，可有效放大電化學(xué)檢測信號，實(shí)現(xiàn)對Aβ40單體的高靈敏和高選擇性檢測[22]。他們還發(fā)現(xiàn)，Aβ40單體抗體對Aβ40單體和磷酸化Aβ40單體具有相近的親和力，并在Aβ40單體抗體固定的金電極上實(shí)現(xiàn)了Aβ40單體和磷酸化Aβ40單體的共免疫捕獲和電化學(xué)定量分析[23]。此外，抗體固定化對電化學(xué)免疫傳感器的發(fā)展起著重要的作用。出色的抗體固定化方法不僅能固定高密度的抗體，還能使抗體的生物活性免遭破壞。Carneiro等[25]利用通過結(jié)合Aβ部分結(jié)構(gòu)（1?17氨基酸）而特異性識別Aβ1-42的大鼠單克隆抗體（DE2B）作為識別單元，通過硫醇化作用使抗體DE2B功能化，促進(jìn)具有適當(dāng)取向的抗體固定，以增加抗體和Aβ1-42的接觸機(jī)率，從而構(gòu)建出無標(biāo)記的、可檢測Aβ1-42的電化學(xué)免疫傳感器。該特異性檢測Aβ1-42的電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度高，在阿爾茲海默癥早期診斷中具有應(yīng)用前景。Yoo等[26]利用交叉微電極傳感器系統(tǒng)作為阿爾茲海默癥血液診斷的傳感平臺，開發(fā)了一種阻抗免疫傳感器，用于檢測Aβ。該傳感器系統(tǒng)通過結(jié)合信號處理系統(tǒng)和血漿到緩沖液的介質(zhì)更換技術(shù)，展現(xiàn)了高度的靈敏性，可檢測到血液中超低的Aβ濃度（pg/mL），而且，該具有更換介質(zhì)能力的傳感系統(tǒng)可用于野生型和轉(zhuǎn)基因型大鼠血漿樣品中Aβ的檢測，展現(xiàn)出在阿爾茨海默癥血液診斷中區(qū)分健康人和患者的潛力。在另一種阻抗免疫傳感器的構(gòu)建中，Zakaria等[27]發(fā)展了一種新型抗體固定方法，是將盤形Pt/Ir微電極與導(dǎo)電芳香族聚合物電聚合后，通過戊二醛交聯(lián)以固定單克隆的Aβ抗體。與基于吸附、被動修飾抗體的策略相比，該抗體固定方法在檢測精度、穩(wěn)定性和靈敏度等方面，極大地提升了Aβ1-40的阻抗檢測性能。該免疫傳感器對Aβ1-40檢出限為4.81 pg/mL。該免疫傳感器通過測試感染阿爾茨海默癥的大鼠腦組織樣品，證實(shí)其在阿爾茨海默癥的早期診斷中具有實(shí)際應(yīng)用價值。

用于檢測Aβ的三明治夾心型電化學(xué)免疫傳感器通常還需進(jìn)行抗體固定化操作，如固定抗體所需連有標(biāo)記物的納米顆粒。Han等[28]利用封裝在鋅?金屬?有機(jī)框架（Zn?MOF）中的電化學(xué)活性分子（二茂鐵，F(xiàn)c）作為信號標(biāo)簽，設(shè)計(jì)了一種可檢測Aβ的電化學(xué)三明治夾心型免疫傳感器。該傳感器在極性有機(jī)溶劑和酸/堿環(huán)境中仍能表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。在該Fc?Zn?MOF結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步修飾金納米顆粒（Au nanoparticles， Au NPs），以作為固定抗體（Ab2）的裝載平臺，所制得的免疫傳感器在Aβ檢測中展現(xiàn)出高靈敏性，其線性檢測范圍為0.0001～100 ng/mL，檢出限為0.03 pg/mL。最近，Gao等[29]利用介孔CeO2包埋AuCuxO（AuCuxO @m?CeO2）納米復(fù)合材料作為催化基質(zhì)，構(gòu)建了基于修飾有Au NPs的還原氧化石墨烯（Au@rGO）傳感平臺的三明治夾心型電化學(xué)免疫傳感器，用于Aβ單體的檢測。如圖1所示，在該傳感器中，通過m?CeO2與抗體的羧基官能團(tuán)的橋接鍵合固定高密度的抗體。該傳感器對Aβ具有極高的靈敏度和較寬的檢測范圍（100 fg/mL～10 ng/mL）。另外，Diba等[30]報(bào)道了一種三明治夾心型電化學(xué)免疫分析方法。在該方法中，抗體（12F4和1E11）需固定在用硫醇修飾的聚乙二醇（PEG?SH）和3?巰基丙酸（MPA）功能化的金納米粒子上。該電化學(xué)免疫傳感器對Aβ檢測具有超高靈敏度，其線性響應(yīng)范圍較寬（100 fmol/L～25 pmol/L），檢出限較低（100 fmol/L）。

此外，近年還出現(xiàn)了無需復(fù)雜操作步驟的的抗體固定方法。如利用經(jīng)過氧等離子體處理的rGO可直接固定抗體，并構(gòu)建出新型電化學(xué)免疫傳感器，并特異性檢測Aβ[31]。rGO經(jīng)過氧等離子體處理可改善其表面在生物作用中的敏感程度（圖2），rGO表面的特異性靶向作用增強(qiáng)了3.33倍，而且，與基于未經(jīng)處理的rGO構(gòu)建的免疫傳感器相比，該免疫傳感器的電信號響應(yīng)增強(qiáng)了3.94倍。

2.2?凝溶膠蛋白識別元件

1990年首次報(bào)道了凝溶膠蛋白對Aβ的識別能力。凝溶膠蛋白是一種分泌蛋白，可特異性結(jié)合Aβ1-40和Aβ1-42單體[32]，但無法識別Aβ的低聚體構(gòu)象，是一種新型可代替抗體的特異性檢測Aβ1-40或Aβ1-42單體的生物識別元件。因此，凝溶膠蛋白可用于構(gòu)建無昂貴抗體的檢測Aβ1-40/1-42單體的新型電化學(xué)傳感器。如Yu等[33]利用金納米顆粒（Au NPs）和多層碳納米管（MWCNTS）為電極基底，以改善傳感過程中的電子轉(zhuǎn)移，將凝溶膠蛋白受體固定在電極表面。具體地，凝溶膠蛋白特異性結(jié)合Aβ1-40/1-42單體后，再與凝溶膠蛋白和硫堇（Thionine， Th）標(biāo)記的金納米顆粒結(jié)合。然后，通過電化學(xué)檢測Th的還原，以定量分析Aβ1-40/1-42單體濃度。電化學(xué)傳感原理如圖3所示。該傳感器的檢測范圍為0.2～40 nmol/L， 檢出限約為50 pmol/L。

利用該傳感器檢測感染阿爾茨海默癥大鼠的腦脊液（CSF）和大腦中的Aβ1-40/1-42單體發(fā)現(xiàn)，其Aβ1-40/1-42單體濃度水平低于正常大鼠。最近，Yu等[34]設(shè)計(jì)了另一種可特異性檢測Aβ1-40/1-42單體的基于凝溶膠蛋白的電化學(xué)傳感器。具體地，Aβ1-40/1-42單體與電極表面固定化的凝溶膠蛋白結(jié)合后，再附著辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記的Au NPs，在H2O2存在時通過催化3，3，5，5′?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）放大電化學(xué)信號，以產(chǎn)生可測量的信號。該傳感器對Aβ1-40/1-42具有較高的靈敏度，其線性檢測范圍為0.1～50 nmol/L，檢出限為28 pmol/L，具有檢測正常大鼠和感染阿爾茨海默癥大鼠腦內(nèi)Aβ1-40/1-42水平的能力。

3?Aβ低聚物的檢測

3.1?適配體識別元件?適配體是一種短的單鏈DNA或RNA分子，可利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)在體外篩選獲得[35，36]。與抗體相比，適配體具有功能修飾簡單的特點(diǎn)，在選擇性結(jié)合各種目標(biāo)分子時更為高效[36]。適配體還具有合成容易、穩(wěn)定性好和成本低等優(yōu)點(diǎn)，在阿爾茨海默癥的早期診斷中是替代昂貴抗體的新一代生物識別元件。Tsukakoshi等[37]首次報(bào)道了一種能選擇性結(jié)合Aβ低聚物，但不能識別Aβ單體或纖維的DNA適配體。該DNA適配體可通過輔以競爭性篩選方法的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)方法分離得到。隨后，Zhou等[38]利用該適配體和可特異性識別Aβ低聚物的抗體作為識別元件、Th修飾的Au NPs作為檢測元件，以電化學(xué)檢測Aβ低聚物。由于適配體和抗體皆對Aβ低聚物具有高特異性識別能力，而且將Th加載到Au NPs表面放大了電化學(xué)信號，該電化學(xué)傳感器對Aβ低聚物具有極高的靈敏度，其檢出限為100 pmol/L。該傳感器可用于檢測人造腦脊液中的Aβ低聚物濃度。最近，Zhang等[39]利用ssDNA適配體作為識別元件，構(gòu)建了一種用于Aβ低聚物檢測的無標(biāo)記電化學(xué)傳感器，其原理是使用電化學(xué)阻抗譜監(jiān)測氧化還原電對[Fe（CN）6]3/4的電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化。如圖4所示，ssDNA適配體可通過識別AuS鍵結(jié)合在金電極表面形成自組裝單分子層，以特異性結(jié)合Aβ低聚物。由于ssDNA核酸適配體識別元件的高靈敏性，該電化學(xué)傳感器具有較寬的線性檢測范圍（0.1～500 nm），檢出限為0.03 nmol/L。另外，該適配體傳感器還能監(jiān)測Aβ蛋白的聚集和檢測人造腦脊液中Aβ低聚物的濃度。

3.2?姜黃素識別元件

姜黃素是一種從姜黃植物中提取的天然多酚。由于其具有抗糖尿病、抗癌、和抗淀粉樣蛋白活性等多種生物活性，姜黃素是糖尿病、癌癥和神經(jīng)退行性疾?。ㄓ绕涫前柎暮Ｄ。┑榷喾N疾病的候選藥物[40，41]。最近的研究還表明，姜黃素的疏水基團(tuán)可與Aβ低聚物的非極性區(qū)域通過疏水作用產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用[41，42]。因此，姜黃素可作為電化學(xué)傳感器的生物識別元件，選擇性地檢測Aβ低聚物。近年來，Qin等[43]利用姜黃素作為生物識別元件，設(shè)計(jì)了一種檢測Aβ低聚物的電化學(xué)傳感器。如圖5所示，姜黃素?鎳聚合物通過電化學(xué)聚合作用沉積在泡沫鎳基體上。姜黃素中存在鎳，有助于增加電導(dǎo)率和粘附泡沫鎳基體的能力。泡沫鎳基體是一種多孔結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)電子傳輸并提高電化學(xué)性能。該電化學(xué)傳感器具有極高的靈敏度，對Aβ低聚體濃度線性檢測范圍為0.001～5 nmol/L。此外，該傳感器能檢測人造腦脊液中的Aβ低聚體濃度，在阿爾茨海默病早期診斷中具有應(yīng)用潛力。

3.3?肽識別元件

近年來，蛋白質(zhì)結(jié)合肽由于其氨基酸的化學(xué)多樣性而具有廣泛的靶標(biāo)范圍，是一種頗有前景的適配體替代物[44，45]。2012年，Li等[46]報(bào)道了具有特定氨基酸序列（RGTWEGKWK）的寡肽可用作Aβ 1-42低聚物的識別元件。通過氨基酸側(cè)鏈間的疏水相互作用，該寡肽可通過脊?槽匹配的方式捕獲Aβ低聚物[47]。此外，修飾有Fc的寡肽可修飾在電極表面，以構(gòu)建檢測Aβ低聚物的電化學(xué)傳感器[46]。該傳感器的檢測范圍為480 pmol/L～12 nmol/L。Li等[48]還將該具有Aβ低聚物結(jié)合能力的寡肽與一種信號讀出技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建出另一種檢測Aβ低聚物的電化學(xué)傳感器。該傳感器可通過寡肽和電化學(xué)識別元件間的非共價耦合，以獲得可靠并有效的電化學(xué)信號。這種基于肽識別元件的電化學(xué)傳感器具有較低的檢出限，約為0.048 nmol/L。

3.4?細(xì)胞朊蛋白識別元件

細(xì)胞朊蛋白（PrPC）是一種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膜結(jié)合糖蛋白，因其可特異性識別Aβ低聚物，引起了廣泛關(guān)注[49，50]。與Aβ低聚物相互作用的PrPC核心區(qū)域是帶有THSQWNKPSKPKTNMK氨基酸序列的PrP（95-110），位于非結(jié)構(gòu)化的N?末端區(qū)域。PrPC與Aβ低聚物間相互作用的離解常數(shù)能通過細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)、表面等離子體共振檢測、解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖邫z測等多種技術(shù)分析。一些研究表明，PrP（95-110）對Aβ低聚物具有極高的特異識別能力，而且無法結(jié)合Aβ單體和Aβ纖維[51]。因此，PrP（95-110）可作為一種頗有前景的、選擇性檢測Aβ低聚物的生物識別元件。 Rushworth等[52]報(bào)道了基于PrP（95-110）識別元件可特異性檢測Aβ低聚物的電化學(xué)傳感器， 利用含有PrP（95-110）片段的合成肽作為識別元件，設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記的電化學(xué)傳感器以檢測Aβ低聚物。生物素化的PrP（95-110）識別元件通過強(qiáng)生物素和NeutrAvidin相互作用，生物素化的PrP（95-110）受體通過生物素和中和親和素的強(qiáng)烈相互作用層層自組裝在建在聚合物涂覆的絲網(wǎng)印刷金電極的表面。利用循環(huán)伏安法、電化學(xué)阻抗譜法和掃描電子顯微鏡證實(shí)該組裝過程的完成。該傳感器在Aβ低聚物或Aβ單體存在時通過電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行測試。由于其使用的識別元件，PrP（95-110）具有特異性識別Aβ低聚物的特點(diǎn)，該電化學(xué)傳感器能在Aβ濃度為100 pmol/L時區(qū)分Aβ單體和Aβ低聚物。而且，該傳感器對Aβ低聚物具有較高的靈敏度，其檢出限約為0.5 pmol/L。該傳感器還能檢測復(fù)雜基質(zhì)中呈現(xiàn)的天然細(xì)胞衍生的Aβ低聚物，展現(xiàn)出其在阿爾茨海默癥早期診斷中的巨大潛力。Liu等[53]使用另一種含有PrP（95-110）片段的合成肽，構(gòu)建了用于檢測Aβ低聚物的靈敏且具有選擇性的電化學(xué)傳感器。將連有PrP（95-110）片段的半胱氨酸修飾在金電極表面，用于特異性捕獲Aβ低聚物。捕獲的Aβ低聚物可進(jìn)一步由堿性磷酸酶偶聯(lián)的PrP（95-110）特異性識別。此外，為了提高Aβ低聚體特異性傳感器的靈敏度，在檢測時使用“從外層到內(nèi)層”電化學(xué)?化學(xué)?化學(xué)（ECC）氧化還原循環(huán)反應(yīng)放大電化學(xué)信號，傳感器能達(dá)到較低的檢出限（3 pmol/L）。該傳感器還可用于分析生物基質(zhì)（如血清）中的Aβ低聚物濃度。

此外，利用Aβ低聚物抑制PrP（95-110）誘導(dǎo)的金屬納米顆粒聚集，可用于Aβ低聚物的電化學(xué)檢測。如Xia等[54]以金剛烷（Adamantine， ADA）標(biāo)記的PrP（95-110）作為識別元件，銀納米顆粒（Ag NPs）作為氧化還原元件，設(shè)計(jì)了另一種靈敏的、可選擇性檢測Aβ低聚物的電化學(xué)方法。ADA?PrP（95-110）誘導(dǎo)Ag NPs聚集形成ADA?PrP（95-110）?Ag NPs網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。然后將該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)通過ADA和β?環(huán)糊精（β?CD）間的主客體相互作用固定在β?環(huán)糊精（β?CD）修飾的電極表面。ADA?PrP（95-110）?Ag NP通過銀納米顆粒的固態(tài)Ag/AgCl反應(yīng)放大電化學(xué)信號。當(dāng)存在Aβ低聚物時，ADA?PrP（95-110）?Au NPs網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的PrP（95-110）將與Aβ低聚物作用，失去與Ag NPs結(jié)合的能力，從而在電極表面有Ag NPs網(wǎng)絡(luò)形成（圖6）。伴隨著Aβ低聚物濃度從20 pmol/L升高至100 nmol/L，該傳感器呈現(xiàn)出減弱的電化學(xué)信號，其檢出限為8 pmol/L。隨后，Xing等[55]也利用Aβ低聚物抑制PrP（95-110）誘導(dǎo)的Ag NP聚集現(xiàn)象構(gòu)建了另一種可特異性檢測Aβ低聚物的電化學(xué)傳感器。將PrP（95-110）固定在電極表面以誘導(dǎo)溶液中的Ag NPs在電極表面的原位聚集，從而放大電化學(xué)信號。當(dāng)Aβ低聚物存在時，PrP（95-110）可與Aβ低聚體相互作用，并將電極表面結(jié)合的Ag NPs重新釋放到溶液中，產(chǎn)生相對較弱的電化學(xué)信號。該傳感器的具有較低的檢出限（6 pmol/L），并能分析復(fù)雜生物基質(zhì)（包括血清和人造腦脊液）中的Aβ低聚物濃度。此外，Xia等[56]還發(fā)現(xiàn)PrP（95-110）能引起Au NPs的聚集，而Aβ低聚物可通過與PrP（95-110）結(jié)合阻止Au NPs的聚集。在上述電化學(xué)傳感器中將Ag NPs替換成Au NPs，可設(shè)計(jì)出類似的檢測Aβ低聚物的電化學(xué)方法。

值得注意的是，這些基于PrP（95-110）識別元件的可檢測Aβ低聚物的電化學(xué)傳感器需要標(biāo)記肽底物和氧化還原介體，以獲得放大的電化學(xué)信號，這可能導(dǎo)致有限的檢測范圍和復(fù)雜的制備過程。最近，Qin等[57]研發(fā)了一種無需標(biāo)記物和氧化還原介體的、基于PrP（95-110）的新型電化學(xué)傳感器。他們首次使用了導(dǎo)電的聚合物聚乙二醇（吡咯?2?羧酸）（Poly （pyrrole?2?carboxylic acid），PPyCOOH），用于PrP（95-110）識別元件的連接。該傳感器具有極較高的靈敏度，其檢出限為104pmol/L，在阿爾茨海默癥的早期診斷中具有較好的應(yīng)用前景。

3.5?塑性抗體識別元件

塑性抗體具有模擬生物識別的能力，由于其具有合成簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是新一代的抗體及適配體替代物。

最近，Moreira等[58]采用改進(jìn)的蛋白質(zhì)印跡方法合成出可特異性識別Aβ低聚物的塑性抗體。如圖7所示，在Aβ低聚物存在時電聚合α?環(huán)糊精（α?Cd）形成α?Cd聚合物膜，通過酸處理除去包埋在α?Cd聚合物膜中的Aβ低聚物，從而得到可特異性結(jié)

合Aβ低聚物的塑性抗體。采用方波伏安法和電化學(xué)阻抗譜法測定該塑性抗體、α?Cd聚合物膜與Aβ低聚物再結(jié)合的能力。該聚合物膜展現(xiàn)出良好的分析性能，在方波伏安法測試中的檢出限為0.20 ng/mL，在電化學(xué)阻抗譜法測試中的檢出限為0.25 ng/mL。他們嘗試將塑性抗體組裝在電活性膜表面，構(gòu)建了無需氧化還原元件的檢測Aβ低聚物的新型電化學(xué)傳感器[59]。所用塑性抗體可通過在Aβ低聚物存在時電聚合苯胺得到。而包埋在苯胺聚合物膜Aβ低聚物隨后通過酸處理除去，從而在聚合物膜中產(chǎn)生空位。該空位在電化學(xué)檢測時可重新結(jié)合Aβ低聚物，即實(shí)現(xiàn)對Aβ低聚物的特異性識別。該傳感器由于缺少氧化還原元件，在方波伏安法測試中性能更優(yōu)，其檢出限低至（0.40±0.03） pg/mL。

4?Aβ纖維的檢測（抗體識別元件）

用于構(gòu)建檢測Aβ纖維的電化學(xué)傳感器的生物識別元件主要是抗體。常見的用于特異性識別Aβ纖維的抗體是一種通過對家兔使用Aβ1-42纖維免疫處理后獲得的免疫血清（OC）[60]?？贵wOC可與Aβ纖維特異性結(jié)合，但不能識別Aβ單體或可溶性Aβ低聚物，因此可作為電化學(xué)傳感器中的生物識別元件，以特異性檢測Aβ纖維。如Veloso等[61]利用抗體OC和A11作為生物識別元件構(gòu)建了一種電化學(xué)免疫傳感器，以監(jiān)測Aβ纖維和其低聚物的分布情況。該免疫傳感器能通過動態(tài)分析Aβ低聚物和其纖維的分布變化，快速地綜合評估均三嗪源性聚集分子（TAE?1、TAE?2）對Aβ聚集的影響。近期，Jeong等[62]研發(fā)了一種電化學(xué)多路免疫傳感器，該傳感器基于還原氧化石墨烯（rGO），能在同一Aβ流體樣本中分別檢測Aβ1-40單體、Aβ低聚物和Aβ纖維。該傳感器使用3種不同的抗體（6E10、A11和OC）作為生物識別元件，固定在修飾有官能團(tuán)的rGO表面，分別用于3種構(gòu)象的Aβ1-40特異性識別。該傳感器對每種Aβ1-40構(gòu)象均展現(xiàn)出較高的分析靈敏度，其具有較寬的動態(tài)檢測范圍（1 pg/mL～10 ng/mL）。最近出現(xiàn)了基于雙抗體（A11和OC）的雙通道電化學(xué)免疫傳感器，能同時檢測Aβ低聚物和Aβ纖維（圖8）[63]。該傳感器可通過定量分析Aβ低聚物和Aβ纖維的濃度比例，追蹤感染阿爾茨海默癥的大鼠腦脊液和腦組織中Aβ的聚集過程，在阿爾茨海默病早期診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

5?總結(jié)和展望

許多電化學(xué)傳感器嚴(yán)重依賴特定的抗體?抗原相互作用，尤其是用于檢測Aβ單體和Aβ纖維的傳感器。然而，由于抗體的生產(chǎn)復(fù)雜且昂貴，通常導(dǎo)致利用抗體作為生物識別元件的電化學(xué)方法需要較高的成本。因此，具有特異性靶向作用的新的生物識別元件賦予了電化學(xué)傳感器新的發(fā)展空間。近期，對于檢測Aβ單體，抗體和凝溶膠蛋白是電化學(xué)傳感器常用的生物識別元件; 對于電化學(xué)檢測Aβ低聚物，目前已發(fā)現(xiàn)適配體、姜黃素、肽、PrP（95-110）和塑性抗體等多種生物分子對其均具有特異性結(jié)合能力，可替代昂貴的抗體; 對于檢測Aβ纖維，現(xiàn)今可用的生物識別元件較少，這方面的研究有望成為將來的研究熱點(diǎn)?？傮w而言，基于生物受體的Aβ電化學(xué)傳感器的研究仍處于初步階段，亟需新的識別原理、新的識別元件的設(shè)計(jì)和高分析性能檢測方法上的突破。另一方面，目前很少有研究關(guān)注通過使用電化學(xué)方法分析單個液體樣品中的3種Aβ構(gòu)象，以監(jiān)測動態(tài)Aβ聚集過程。而監(jiān)測人腦中的Aβ聚集過程對于與阿爾茨海默病相關(guān)的發(fā)病機(jī)理的實(shí)時評估具有重要意義。未來的研究應(yīng)致力于設(shè)計(jì)基于多個生物受體的新型電化學(xué)傳感器，以便在單個分析系統(tǒng)中同時檢測不同Aβ構(gòu)象。

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Electrochemical Sensors Based on Bioreceptors for Detecting

Different Conformations of Amyloid?β Peptides

WANG Jian?Xing2， TIAN Meng1， SHU Tong2， SU Lei*2， LIU Guo?Dong1， ZHANG Xue?Ji*3

1（Research Center for Biomedical and Health Science， Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China）

2（Beijing Advanced Innovation Center of Materials Genome Engineering， Beijing Key Lab for Bioengineering

and Sensing Technology， School of Chemistry and Biological Engineering，

Beijing Science and Technology University， Beijing 100083， China）

3（School of Biomedical Enginering， Shenzhen University， Shenzhen 518055， China）

Abstract?Alzheimer's disease （AD） has attracted extensive attention because it is a fatal and irreversible progressive neurological disorder and its incidence exponentially increases with age. The early diagnosis of AD has become an urgent prerequisite for its treatment. At present， one of the most important biomarkers for the early diagnosis of AD is amyloid?β peptides （Aβ）. Owing to the advantages of electrochemical detection， lots of electrochemical biosensors have been developed for detection of Aβ. In the present review， from the standpoint of Aβ bioreceptors， we summarize the progresses in the electrochemical sensors for detection of Aβ monomers， Aβ oligomers and Aβ fibrils， respectively in the recent five years.

Keywords?Alzheimer's disease; Early diagnosis; Amyloid?β peptides; Electrochemical biosensors; Review