張 賀,姜大慶
1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院2017級碩士研究生 (沈陽 110167);2.遼寧省腫瘤醫(yī)院乳腺外科(沈陽 110042)
乳腺癌作為女性最常見的癌癥診斷及死因,其發(fā)病率已占全球癌癥新發(fā)病例的11.6%[1-3]。鴉膽子,又稱苦參子、老鴉膽,為苦木科植物鴉膽子[Brucea javanica (L.)Merr.]的干燥成熟果實,為治療癌癥常用中藥材。鴉膽子素D(Bruceine D,BD)是從中藥鴉膽子中分離提取的一種水溶性三環(huán)四萜類化合物。已有證據(jù)表明BD在肝癌、胰腺癌及慢性粒細(xì)胞白血病中有抑制癌細(xì)胞增殖的作用,BD通過調(diào)節(jié)microRNA-95發(fā)揮其對HCC的抗癌活性,通過p38-MAPK及NF-kB途徑促進(jìn)胰腺癌凋亡[4-5]。Zhang JY等亦發(fā)現(xiàn)BD可通過線粒體途徑誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡[6]。但其對乳腺癌的影響尚未報道,故本實驗研究其對MDA-MB-231細(xì)胞株抗癌活性,并探討其可能機(jī)制及通路,以期為乳腺癌開發(fā)新藥提供思路。
1 試 劑 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中科院上海細(xì)胞庫。鴉膽子素D(CAS:21499-66-1,20mg,HPLC≥98%,貨號:B21415)購自上海源葉生物科技有限公司。1640培養(yǎng)液(RPMI 1640)、DMEM培養(yǎng)液購于Hyclone公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS(磷酸鹽緩沖液)購于Genvew公司;胎牛血清(FBS)購于Clark公司;CCK-8試劑購于Vazyme公司;碘化丙錠溶液購于北京鼎國盛生物技術(shù)有限公司;凋亡試劑盒購于碧云天有限公司、RIPA裂解液購于中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
2 儀 器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo-371,德國 Thermo scientific 公司)、超凈臺(DL-CJ-2N,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、熒光顯微鏡(LeicaDMi8,德國Leica公司)、離心機(jī)(Centrifμge 5804R,德國 Eppendorf 公司)、流式細(xì)胞儀(FACSAriall,美國BD公司)。
3 方 法
3.1 溶藥:BD用DMSO溶解后,配成20 mmol/L的母液分裝,置于-20℃冰箱冷藏備用。
3.2 細(xì)胞培養(yǎng): MDA-MB-231細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、1×108U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)。每2~3天胰酶消化傳代。
3.3 CCK8法檢測細(xì)胞活性: 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞,按6000個/孔鋪96孔板,3個板均孵育24 h。 母液稀釋配藥,不同濃度BD(0、3、5、10、30、50 μmol/L),每組5個復(fù)孔加藥。標(biāo)記號碼及時間,分別孵育24、48、72 h。 每孔加10 μl CCK-8,37 ℃孵育4 h酶標(biāo)儀檢測,波長在450 nm測各孔吸光度值,實驗重復(fù)3次,計算IC50。
3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞,按1.5× 105個/孔接種至六孔板,孵育24 h。根據(jù)上述IC50值(28 μmol/L),加入(0、10、30、50 μmol/L)的BD,作用24 h后消化離心,預(yù)冷PBS沖洗后,100 μl 1×緩沖液重懸細(xì)胞。 蒸餾水按4∶1比例稀釋5× Annexin V結(jié)合緩沖液,用1×結(jié)合緩沖液10∶1比例稀釋PI。 每管加入3 μl的FITC-Annexin V和2 μl的PI,室溫避光孵育15 min。 每管加400 μl的1×結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測,F(xiàn)lowJo V10軟性分析,實驗重復(fù)3次,計算細(xì)胞凋亡率。
3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞,按1.5× 105個/孔接種至六孔板,設(shè)置空白對照組,PI陰性對照組,0、10、30、50 μmol/L的BD組,孵育24 h。 加入1 ml冰浴預(yù)冷的70%乙醇,4℃固定12 h。 每管加入0.5 ml碘化丙啶染色液,37 ℃避光溫浴30 min后4 ℃冰浴避光存放,流式細(xì)胞儀檢測,CellQuest軟件分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。
4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理實驗數(shù)據(jù),結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 不同濃度BD(0、3、5、10、30、50 μmol/L)分別作用24、48、72 h后MDA-MB-231細(xì)胞存活率如表1所示??梢娤嗤瑫r間隨藥物濃度增加,細(xì)胞存活率降低;且相同濃度隨作用時間增加,細(xì)胞存活率降低。24、48及72 h的IC50值分別為28、13、7 μmol/L即BD抑制乳腺癌細(xì)胞增殖呈時間劑量依賴性,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表1 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
注:與對照組0 μmol/L相比,各項均P<0.05
2 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 采用含0、10、30、50 μmol/L的BD處理MDA-MA-231細(xì)胞24 h后,如表2所示。總細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的百分比分別為6.69%、15.12%、35.83%和40.67%,與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明BD劑量依賴性的誘導(dǎo)MBA-MB-231細(xì)胞凋亡。
表2 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響
注:與對照組0 μmol/L相比,各項均P<0.05
3 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細(xì)胞周期的影響 用含0、10、30、50 μmol/L的BD處理MDA-MA-231細(xì)胞24 h后,流式細(xì)胞儀分析檢測其各周期占比。如表3所示,BD以劑量依賴性誘導(dǎo)G0/G1期的MDA-MA-231細(xì)胞的百分比增加,經(jīng)0、10、30、50 μmol/L的BD作用24 h后,G0/G1期的乳腺癌細(xì)胞占比分別為31.45%、40.93%、 57.16%、 66.38%。可見隨藥物濃度增加,處于G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增加,G2/M期的細(xì)胞比例下降,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表3 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細(xì)胞周期的影響
注:與對照組0 μmol/L相比,各項均P<0.05
鴉膽子首載于清代醫(yī)學(xué)家趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》中,具有清熱解毒,殺蟲截瘧的功效?,F(xiàn)代鴉膽子主要用于抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗瘧等領(lǐng)域。南新記等研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子油注射液對激素抵抗性前列腺癌VEGF C及血清PSA水平均有明顯影響,且顯著降低其化療后不良反應(yīng)[7]。王立軍等在鴉膽子甲醇提取物中分離出11種化合物,其中鴉膽子內(nèi)酯A和鴉膽子素D對癌細(xì)胞株有明顯抗癌作用[8]。Liu等發(fā)現(xiàn)BD在胰腺癌中對Panc-1、SW1990及Capan-1等多種細(xì)胞系均存在很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用,且其研究表明BD的抗增殖作用與吉西他濱及喜樹堿相當(dāng),BD以劑量依賴性增加subG1期的Capan-2細(xì)胞百分比,表明BD通過線粒體途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡[9]。Cheng等研究發(fā)現(xiàn)BD顯著抑制肝腫瘤細(xì)胞生長并增強(qiáng)索拉菲尼在大鼠HCC中的治療效果,其機(jī)制為BD促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的蛋白酶體降解和其核積累的消耗,反過來破壞HCC中Notch配體Jagged1的Wnt/β-連環(huán)蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄[10]。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)鴉膽子素D可抑制HPV 16 E6、HPV 16 E7 mRNA的表達(dá),抑制HPV 16細(xì)胞增殖,BD誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制與JNK蛋白相關(guān)[11-13]。安改麗等研究發(fā)現(xiàn)miR-145可通過抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表達(dá)來增加MCF-7/ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性和凋亡[14]。
已知細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長抑制的主要途徑,其涉及一系列基因的激活、表達(dá)與調(diào)控。在哺乳動物細(xì)胞中,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)分兩大類,即內(nèi)源性途徑和外源性途徑。內(nèi)源性途徑亦稱為線粒體途徑,包括線粒體在執(zhí)行凋亡程序的半胱天冬酶級聯(lián)起始中的作用[15]。本研究闡明BD誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡是其抑制乳腺癌細(xì)胞生長的主要機(jī)制,后續(xù)實驗室將進(jìn)一步明確BD促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。