瑪咖多糖提取過程的原位實時監(jiān)測技術研究

孔 娜 楊 雪 王禹程 黃姍芬 李云亮 馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院 江蘇鎮(zhèn)江 212013）

目前常用的檢測多糖的方法為苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法[6]。多糖的傳統檢測方法由于人為原因出現誤差，整個檢測過程繁瑣，還會導致實際測量的化學值與生產過程之間存在延遲或者誤差，不能實現提取過程中多糖含量變化的原位監(jiān)測。對提取過程中重要參數建立快速、穩(wěn)定和可靠的在線監(jiān)測方法的研究顯得極為重要。

近紅外光譜因快速、無損、便攜等優(yōu)點廣泛而被應用于目標物質的監(jiān)測。Mizushima等[7]對聚乙烯拉伸變形過程中的結構變化進行原位近紅外光譜監(jiān)測；Wold等[8]也利用近紅外成像光譜儀在線確定完整牛肉配件的脂肪含量；Sampaio等[9]利用原位近紅外光譜監(jiān)測重組釀酒酵母菌株生產的番茄紅素的含量；Prieto等[10-11]也將近紅外光譜應用于在線的工業(yè)加工，包括對輸送機上小牛肉樣本中的脂肪、水分和蛋白質含量的在線監(jiān)測，同時也應用于運送牛肉和豬肉樣品在輸送帶或絞肉機出口上化學成分的監(jiān)測。上述研究結果表明，近紅外光譜技術可用于監(jiān)測和分析食品在移動的傳送帶上或連續(xù)過程的監(jiān)測[12]。近年來由于微小型光纖的發(fā)展，微小型便攜式近紅外光譜儀可將光纖探頭伸入溶液中采集光譜，可實現原位在線預測目標物質的含量。微小型便攜式近紅外光譜儀因具有速度快、成本低、無污染、預測結果準確等優(yōu)點[13-14]，為實現食品加工過程的自動化控制奠定了基礎[15-16]。

本文主要利用超聲輔助提取瑪咖多糖并應用便攜式近紅外光譜儀實時檢測提取過程中的光譜信息，建立光譜信息與多糖含量之間的數學模型，實現提取過程中對多糖含量的預測，為提取過程終點的判斷提供技術支持。

1 材料和儀器

1.1 材料

瑪咖，青海神農生物科技有限公司（多糖含量67.3%）；其余試劑為分析純級。

1.2 儀器與設備

雙頻逆流聚能式超聲設備，江蘇大學自主研制；DL-5C離心機，上海安亭科學儀器廠；T-6新世紀可見分光光度計，北京普析儀器有限公司；NIRQUEST256-2.5近紅外光譜儀、TP300浸入式光纖探頭、DH-2000-BAL UV-VIS-NIR光源，美國海洋光學。

2 試驗方法

2.1 超聲輔助提取瑪咖多糖及過程中光譜信息采集

用蒸餾水將原料（過60目篩）分別配制為不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 g/mL）的瑪咖懸浮液1 000 mL，設定超聲參數：20～35 kHz交替雙頻，超聲功率150 W/L，超聲溫度50℃，間歇時間比4s/3s，超聲時間 60 min，前 30 min每隔 2 min取樣1次，后30 min每隔3 min取樣1次，共計130個樣品。將所有樣品離心（10 000 r/min離心10 min），收集上清液，放置于-20℃保存待測化學值。取樣同時采集光譜信息，光譜的范圍為900～2 500 nm，分辨率為6.4 nm，掃描8次，光程4 mm，以蒸餾水（50℃）作為背景，每次連續(xù)采集3次光譜信息，取其平均值作為原始光譜數據。

2.2 多糖濃度的離線測定

多糖的含量采用苯酚硫酸法測定[17-19]，以干燥的葡萄糖標準品作為基準物質制作標準曲線，以蒸餾水代替多糖溶液做空白，提取的多糖含量按式（1）計算：

式中，T——提取出的瑪咖多糖含量（%）；C——待測液中多糖質量濃度（mg/mL）；N——稀釋倍數；V——樣液體積（mL）；f——換算因素；m——樣品質量（g）。

常用的原材料有：石灰石、白堊、黏土、頁巖、鐵礦石等。因礦石成分的不確定性，導致水泥中礦物組成變動性大，使水泥與外加劑不相容。

2.3 原位實時監(jiān)測模型的建立

采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）、區(qū)間偏最小二乘法（Interval partial least squares，ipLS）和聯合區(qū)間偏最小二乘法（Synergy interval PLS，si-PLS）對光譜區(qū)間篩選，將篩選出的特征信息與同步測定的多糖含量化學值聯立并建模。

3 結果與分析

3.1 原位實時監(jiān)測超聲輔助提取過程中瑪咖多糖含量的變化

不同料液比提取多糖含量的理化指標如圖1所示，隨著超聲提取時間的延長，多糖含量不斷增加。在提取前15 min，多糖含量增加快速，隨后增加緩慢并出現波動增長的趨勢。說明隨著時間的延長，瑪咖細胞的破碎度逐漸增大，多糖溶出率增加，提取率較高，然而時間過長，會使多糖重聚而沉淀，或由于超聲的強剪切力作用使大分子多糖斷裂，從而出現多糖含量呈波動的變化趨勢[20]。同時監(jiān)測提取過程中不同料液比的多糖含量，可以更全面、更準確的分析數據及建立模型。

圖1 瑪咖多糖在超聲輔助提取過程中含量的變化Fig.1 The content of maca polysaccharide in ultrasonic assisted extraction

3.2 提取過程中原位光譜圖的預處理

通過 Centre、MSC、SG、SNV、1 st、2 st及 Centre、MSC、SG、SNV 分別與 1 st組合預處理原始光譜圖，所有的預處理方法都能很好的消除外界條件的干擾及光譜圖的冗余信息，提取及增強特征信息，提高預測模型的預測能力及穩(wěn)健性。不同方法預處理后的光譜圖如圖2所示。

圖2 不同預處理方法處理瑪咖水溶液近紅外光譜圖Fig.2 Near infrared spectra of maca aqueous solution by different pretreatment methods

將近紅外采集的樣本光譜經過不同的預處理后，用PLS建立模型，同時用校正模型來預測預測集中的瑪咖水溶液中多糖含量，其中以Rc、RMSECV和Rp、RMSEP為評價指標，篩選最優(yōu)預處理方法。由表1可知，不同的預處理方法所得到的建模效果有所差距，其中SG是最有效地預處理方法，Rc和Rp最高且接近 1，RMSECV和RMSEP在所有的預處理中數值最小，所以在后續(xù)將使用平滑處理的光譜用于建模。

表1 不同方法預處理近紅外光譜的結果Table1 Results of near-infrared spectroscopy by different pretreatment methods

3.3 PLS方法的原位實時模型的建立

PLS法是基于全光譜區(qū)間（900～2 500 nm）的1 600個波長變量上建立的監(jiān)測模型，所建立的模型如圖3所示。根據評價標準，選取Rc和Rp相關系數最高和RMSECV、RMSEP最低的建模子區(qū)間，建立最佳的PLS模型。對于多糖檢測模型中，Rc的值為0.9453，RMSECV 值為0.0138，Rp的值為0.9638，RMSEP為0.0144，顯示PLS模型預測具有良好的預測效果。

3.4 iPLS方法的原位實時模型的建立

偏最小二乘法是將整個光譜區(qū)間分為20個子區(qū)間，再對每個子區(qū)間建立模型，根據評價標準，選取Rc和Rp相關系數最高和RMSECV、RMSEP最低的建模子區(qū)間，建立最佳的模型。由圖4和5可知，對于多糖檢測模型中，依據Rc最高為0.9163和RMSECV最低為0.017，在整個光譜區(qū)間的第19個子區(qū)間上所建的模型最佳，該區(qū)間所對應的光譜區(qū)間為2356.166～2425.508 nm，此區(qū)間所建立的模型的Rp為0.9375，RMSEP為0.0178，此模型對多糖含量的預測效果也較好，而PLS法建立的模型比iPLS法可以更好的預測多糖含量。

圖3 PLS建立瑪咖多糖模型的校正集和預測集Fig.3 PLS established correction set and prediction set for the maca polysaccharide model

圖4 iPLS建立瑪咖多糖模型最佳子區(qū)間Fig.4 iPLS established the best subinterval of maca polysaccharide model

圖5 iLPS建立瑪咖多糖模型的校正集和預測集Fig.5 iLPS established calibration set and prediction set for the maca polysaccharide model

3.5 si-PLS方法的原位實時模型的建立

對于聯合區(qū)間偏最小二乘法，在被劃分的第26子區(qū)間并聯合其中4個子區(qū)間時（第7，19，21，24個，所對應的光譜區(qū)間分別為1 258.591～1 316.735 nm，2 027.121～2 084.226 nm，2 153.93～2 210.888nm和2 337.239～2 387.696 nm）所建的模型最佳，如圖6和7，Rc和RMSECV分別為0.9621和0.0116，Rp和RMSEP分別為0.9667和0.0137。此法與PLS法相比，Rp與Rc值均更高，且RMSECV和RMSEP相對來說更低，因此si-PLS法在3種方法中可更好地預測多糖含量。

圖6 si-PLS聯合最佳區(qū)間建立瑪咖多糖模型Fig.6 Establishment of maca polysaccharide model by si-PLS combined with optimal interval

圖7 si-LPS聯合最佳區(qū)間建立模型的校正集和預測集Fig.7 Correction set and prediction set of si-LPS joint optimal interval model

3.6 3種模型的結果比較

為確定定量模型，提高模型的建模效果及預測性能，采用3種方法（最小二乘法、偏最小二乘法、聯合區(qū)間偏最小二乘法）建立模型，以優(yōu)化瑪咖多糖定量預測模型。如表2所示。

表2 不同方法建立多糖含量模型的結果Table2 Results of different methods to establish polysaccharide content model

從表2可以明顯看出，利用近紅外實時采集光譜，并通過化學計量學計算，3種監(jiān)測方法均體現出較好的預測性能，可實現提取過程中多糖含量的快速檢測；另外，比較3種方法可得，iPLS（Rc為0.9163和Rp為0.9375）穩(wěn)定性較好，其次PLS（Rc為0.9453和Rp為0.9638）穩(wěn)定性更好，si-PLS（Rc為0.9621和Rp為0.9667）模型所得校正精度與預測精度最高。3種模型的預測性能出現不同程度地變化，其原因如下：

PLS相比較其它2個建模方法，由于是將整個區(qū)間的1 600個變量用于建模，就會存在很多不相關的參數和冗余的波長變量，使得PLS的建模效果減弱，預測性能降低。全光譜建模的校正集和預測集中的相關系數處于中間，也說明全光譜圖用于建模不會丟失任何數據，只是增加了模型的復雜性，降低了模型的穩(wěn)定性。另外，從校正集的相關系數可看出，多糖的全光譜PLS模型存在一定的擬合過度現象，應該是由于參與建模的主因子數過多引起的。因此，篩選特征光譜區(qū)間對于建模就顯得很重要。

在3個模型中，iPLS模型的預測性低于PLS和si-PLS法。最主要是由于iPLS在建模時只用了一個子區(qū)間上的數據，刪除數據量過大，其中很多特征數據也并未得到利用，且第19個區(qū)間上的數據也不一定是有用數據，最終導致校正集模型和預測集模型的性能都很差。近紅外采集的提取過程中光譜信息所反應的參數，主要來自瑪咖溶液中不同基團伸縮振動的倍頻和合頻的吸收，任何一個單獨的區(qū)間都不能完全反應光譜信息。

Si-PLS模型的預測性能要優(yōu)于PLS模型和iPLS模型。該方法相比較其它兩種方法的優(yōu)點是，既可剔除很多無用光譜信息，也盡可能多地提取并利用有用信息，聯合4個相關的子區(qū)間，建立最佳的預測模型。同瑪咖多糖相關的變量信息，可能是不連續(xù)的且分散在整個光譜區(qū)間上，會存在一些子區(qū)間共線性的變量。本試驗將不連續(xù)且分散在整個光譜區(qū)間上的4個子區(qū)間聯合并建立模型，具有更好的預測效果。

4 結論

1）為擴展樣本的數據范圍，將 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 g/mL 不同料液比的瑪咖懸浮液作為在線監(jiān)測樣本。近紅外對瑪咖溶液提取過程進行原位實時光譜的采集，并同時收集樣品，采用苯酚硫酸法離線檢測其提取過程中的多糖含量。

2）對瑪咖溶液提取過程中的原位光譜進行中心化、中心化與一階導數、多元散射校正、多元散射校正與一階導數、平滑、平滑與一階導數、標準正態(tài)變量變換、標準正態(tài)變量變換與一階導數、一階導數和二階導數不同方法的預處理，其中平滑預處理后，PLS建模效果最佳。

3）以相關系數和相對誤差為評價指標，采用最優(yōu)光譜波長區(qū)間建立瑪咖多糖的Si-PLS模型。其 Rc、Rp和RMSECV、RMSEP 分別為0.9621，0.9667和0.0116，0.0137。 另外 Si-PLS與PLS和iPLS建模方法相比，可以在很大程度上減少建模時所需要的波點數，提取并結合子區(qū)間，利用了原料溶液中的特征信息，能夠很有效的提高模型的預測能力，增加模型的穩(wěn)定性，可以實現提取過程參數的在線監(jiān)測。