地塞米松對反復(fù)種植失敗患者外周血Th1/Th2細胞比例失衡的調(diào)節(jié)作用

邢俊，王俊霞，王玢，孫海翔

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210008)

IVF助孕過程中，5%～11% 的患者表現(xiàn)為反復(fù)種植失敗(RIF)，這不僅給患者造成巨大的心理壓力，同時也對生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)的醫(yī)生提出巨大的挑戰(zhàn)，成為提高輔助生殖技術(shù)(ART)成功率的瓶頸問題。反復(fù)種植失敗中，免疫性因素在不明原因性RIF 中占到80%[1]。

Th(CD3+/CD4+)細胞根據(jù)分泌細胞因子不同分為Th1、Th2及Th17細胞等。其中Th2細胞分泌白細胞介素(Interleukin，IL)-4、IL-10等，參與體液免疫。Th1細胞產(chǎn)生干擾素(IFN)-γ、IL-2及腫瘤壞死因子(TNF)-α，介導(dǎo)細胞免疫和炎癥反應(yīng)。Th1/Th2的平衡對于成功的胚胎種植及妊娠維持非常重要，可以作為種植免疫狀態(tài)的一個有效標(biāo)記。對RIF患者使用免疫調(diào)節(jié)劑或者免疫抑制劑進行治療，是改善RIF患者臨床結(jié)局的一種有效方法[2-5]。長鏈脂肪乳、免疫球蛋白等藥物可以改善RIF患者的免疫失衡，從而改善臨床妊娠[6-7]。但是，目前這些治療花費較高，且僅對部分患者治療有效。因此，進一步尋求RIF患者的免疫治療方案很有必要。

糖皮質(zhì)激素(GC)是一種強烈的免疫抑制劑和抗炎劑，臨床上廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、過敏性疾病和移植排斥反應(yīng)，它也是治療支氣管哮喘最有效的藥物。在多種組織器官中，地塞米松可抑制Th1類細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌，使其對Th2類細胞因子產(chǎn)生的抑制作用減弱，從而使Th1/ Th2平衡偏向Th2應(yīng)答[8]。因此，我們擬對Th1比例異常升高的RIF患者行地塞米松治療，觀察其對Th1/ Th2失衡及臨床結(jié)局的影響。

材料和方法

一、研究對象

選擇2017年2～5月在本中心行輔助助孕后的RIF患者29例，診斷標(biāo)準(zhǔn)：本中心接受≥3個新鮮胚胎移植周期或者FET周期，且累計移植≥4枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能臨床妊娠者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<40歲；(2)基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L；(3)經(jīng)陰道B超證實雙側(cè)卵巢完整且無形態(tài)學(xué)異常；(4)甲狀腺激素、血糖及胰島素等內(nèi)分泌檢查正常；(5)夫妻雙方染色體正常；(6)自身免疫性抗體：抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺抗體、抗β2-糖蛋白1抗體陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮畸形(單角子宮、雙角子宮、雙子宮、縱隔子宮)、子宮腺肌病、粘膜下子宮肌瘤及宮腔粘連；(2)有輔助生育技術(shù)(ART)及妊娠的禁忌證或患有對妊娠有明確影響的疾病的患者：如未控制好的高血壓、心臟病、糖尿病等；(3)移植日子宮內(nèi)膜厚度<7 mm；(4)遺傳性易栓癥。

FET周期安排時，月經(jīng)周期規(guī)律、正常排卵患者采用自然周期；排卵障礙、月經(jīng)不規(guī)律等患者采用雌孕激素替代周期；常規(guī)胚胎移植及黃體支持；于移植后14 d檢測晨尿、 血清HCG水平以確定生化妊娠，移植后28 d超聲檢查見孕囊及胎心搏動，確定臨床妊娠。所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.治療方案及觀察指標(biāo)：給予RIF患者口服地塞米松0.75 mg/月，治療前后分別用流式細胞技術(shù)檢測外周血Th1、Th2細胞亞群比例。

2.流式細胞學(xué)分析：外周血中Th1(CD3+CD4+IFN-γ+/ CD4+)和Th2(CD3+CD4+IL-4+/ CD4+)細胞比例檢測：取1支流式管，加1 μl刺激劑(白細胞激活劑和BD GolgiPlug)(BD Biosciences，美國)至管底，再加入月經(jīng)干凈后1周內(nèi)抽取的50 μl外周靜脈血(肝素抗凝)，震蕩混勻，放37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育5 h(2 h震蕩混勻一次)?；靹蚝蠹尤隒D3 PerCP抗體和CD8 APC抗體各5 μl，避光孵育20 min。加入50 μl固定劑A(FIX & PERM試劑，Life Technologie，美國)，避光孵育15 min后加入2 ml生理鹽水洗滌，1 500 rpm/5 min離心，棄去上清。加入50 μl破膜劑B(FIX & PERM試劑，Life Technologies，美國)，然后加IFN-γ FITC抗體和 IL-4 PE抗體各5 μl，室溫避光孵育30 min。加1 ml生理鹽水洗滌，1 500 rpm/5 min離心后棄去上清，加360 μl鞘液，混勻后上機，用FACSCanto流式細胞儀(BD Biosciences，美國)進行檢測外周血中Th1和Th2細胞比例。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

本研究共納入29例患者，平均年齡(31.52±0.77)歲，不孕年限(5.69±0.56)年，BMI(22.08±0.63)kg/m2，基礎(chǔ)FSH(7.14±0.34)U/L，既往移植失敗周期數(shù)為(3.41±0.19)個，既往移植胚胎數(shù)為(5.83±0.45)枚。前期我們對正常育齡期女性外周血中Th1、Th2細胞比例進行了檢測分析，確定我中心外周血中Th1細胞比例正常范圍為9.0%～31.0%，Th2 細胞比例正常范圍為0.7%～2.6%，相關(guān)研究結(jié)果已發(fā)表[9]。

二、地塞米松治療前、后外周血Th細胞亞群比例變化

口服地塞米松治療后，RIF患者外周血中Th1細胞亞群比例(24.31±7.24)%較治療前(28.60±7.59)%顯著下降(P<0.05)(圖1)；Th2細胞亞群比例(1.11±0.40)%較治療前(1.08±0.39)%雖有上升，但無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

與治療前相比，*P<0.05

圖2 地塞米松治療前、 后外周血Th2亞群比例

三、地塞米松治療前、后外周血Th1細胞亞群比例變化

治療前外周血Th1細胞亞群比例異常升高的RIF患者共12例，進一步觀察這12例患者口服地塞米松后外周血Th1細胞亞群比例變化。結(jié)果顯示，口服地塞米松治療后該組RIF患者外周血中Th1細胞亞群比例(29.97±6.96)%較治療前(35.66±4.36)%顯著下降(P<0.05)(圖3)。截至目前，此12例患者行凍融胚胎移植，6例獲臨床妊娠，其中5例患者已經(jīng)分娩，1例患者早孕期自然流產(chǎn)。

與治療前相比，*P<0.05

四、地塞米松治療前、后外周血Th2細胞亞群比例變化

治療前外周血Th2細胞亞群比例異常降低的RIF患者共6例，進一步觀察這6例患者口服地塞米松后外周血Th2細胞亞群比例變化。結(jié)果顯示，口服地塞米松治療后該組RIF患者外周血中Th2細胞亞群比例(0.80±0.14)%較治療前(0.61±0.09)%顯著上升(P<0.05)(圖4)。截至目前，此6例患者行凍融胚胎移植，3例獲臨床妊娠，均已分娩。

與治療前相比，*P<0.05

討 論

RIF是指年齡<40歲的不孕患者、接受≥3個新鮮胚胎移植周期或者FET 周期、且累計移植≥4枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能臨床妊娠[10]。反復(fù)種植失敗的病因很多，機制未完全明確。其中，免疫微環(huán)境紊亂是造成不明原因反復(fù)種植失敗的一個重要原因。

既往研究認為Thl/Th2型細胞因子參與免疫耐受機制過程，Thl型細胞因子可影響滋養(yǎng)細胞侵蝕過程并抑制子宮內(nèi)膜蛻膜化，并誘導(dǎo)NK細胞的活化、浸潤，介導(dǎo)妊娠早期滋養(yǎng)細胞凋亡而致胚胎死亡；Th2型細胞因子作為免疫調(diào)節(jié)因子，能下調(diào)Thl免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)免疫耐受。Th1/Th2型細胞因子的動態(tài)平衡維持正常妊娠。在正常妊娠女性中，Th2型細胞因子IL-4及IL-10血清水平顯著升高，提示正常妊娠處于Th2偏倚狀態(tài)[11]。

2015年Liang等[12]發(fā)現(xiàn)，在體外受精促排卵周期中，成功妊娠組外周血中Th1類細胞因子TNF-α、IFN-γ的含量較未妊娠組顯著下降。并且，外周血TNF-α、IFN-γ的表達量在3個時間點：GnRHa日、Gn日及HCG扳機日無顯著差異，不隨體內(nèi)雌孕激素量的改變而改變。作者緊接著在2015年的另一篇文章中，進一步對比了34例RIF及25例首次IVF獲得妊娠的IVF患者外周血的Th1、Th2類細胞因子比例，結(jié)果顯示RIF患者外周血Th1類細胞因子/Th2類細胞因子IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10、TNF-α/TGF-β1比例顯著升高，提示RIF患者外周血向促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變[13]。最近有學(xué)者應(yīng)用Th1型細胞因子TNF-α抑制劑治療RIF取得成功，提示Th1/Th2型細胞因子的動態(tài)平衡恢復(fù)有利于妊娠[14]。在本研究中，我們首次檢測了地塞米松對Th1/Th2失衡RIF患者外周血中Th1/Th2平衡的影響。

糖皮質(zhì)激素是一種強免疫抑制劑和抗炎劑，臨床上廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、過敏性疾病和移植排斥反應(yīng)。地塞米松與強的松均屬于臨床上常用的糖皮質(zhì)激素。強的松是半衰期為60 min的短效糖皮質(zhì)激素，而地塞米松是半衰期達200 min的長效糖皮質(zhì)激素。相較于強的松，地塞米松的抑制作用更持久[15]。Agarwal等[8]體外用地塞米松模擬人應(yīng)激時血皮質(zhì)醇升高后的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)地塞米松可抑制IL-12和IFN-γ的分泌，使其對Th2類細胞因子產(chǎn)生的抑制作用減弱，導(dǎo)致IL-4、IL-10和IL-13分泌增多，Th1/ Th2平衡偏向Th2應(yīng)答。另有報道地塞米松可逆轉(zhuǎn)支氣管灌洗液及大腦皮層中IFN-γ/ IL-4的比率，從而恢復(fù)Th1/ Th2平衡[16]。

糖皮質(zhì)激素可作為免疫調(diào)節(jié)劑改善全身免疫環(huán)境，降低子宮自然殺傷(uNK)細胞數(shù)量，使子宮內(nèi)膜細胞因子表達譜正常化，抑制子宮內(nèi)膜炎癥。2012年基于6項RCT研究的META分析顯示，圍著床期使用糖皮質(zhì)激素組較未使用組可以顯著提高IVF患者的臨床妊娠率，但不良反應(yīng)并無增加[17]。一項回顧性研究顯示，自身免疫異常的IVF患者在移植前5周聯(lián)合使用強的松和阿司匹林可以顯著提高其臨床妊娠率[18]。已經(jīng)證實，對包括uNK細胞異常等的過度激活的子宮內(nèi)膜免疫狀態(tài)行強的松治療可以導(dǎo)致更佳的臨床結(jié)局[19-20]。

盡管如此，糖皮質(zhì)激素對RIF患者的免疫治療研究報道較少，效果尚未明確。對子宮內(nèi)膜uNK細胞比例異常升高的RIF患者行宮腔內(nèi)灌注地塞米松，可以降低uNK細胞比例，并改善臨床結(jié)局[2]。對子宮內(nèi)膜局部免疫過度激活的RIF患者予強的松治療后顯示，大部分患者的子宮內(nèi)膜局部TWEAK表達顯著上升，IL-18/TWEAK mRNA比例顯著下降，提示強的松可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部過高的Th-1/Th-2比例[21]。但是，仍有相當(dāng)一部分RIF患者拒絕行子宮內(nèi)膜有創(chuàng)檢查。因此，基于外周血免疫指標(biāo)檢測的糖皮質(zhì)激素治療，檢測微創(chuàng)且易于臨床開展，是一個值得考慮的方法。

即便如此，對RIF患者使用糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用也應(yīng)當(dāng)謹慎和指征明確。胚胎種植及妊娠維持需要前期的激活免疫反應(yīng)及后期的免疫耐受。針對Th1過高或者過低，對不同類型的RIF患者應(yīng)使用不同類型的藥物治療[13]。對所有RIF患者一概而論的使用糖皮質(zhì)激素，利用其抗炎和免疫抑制效應(yīng)是不合適的[22]。

本研究結(jié)果顯示，地塞米松下調(diào)RIF患者異常升高的外周血Th1細胞比例，上調(diào)RIF患者異常下降的外周血Th2細胞比例，對反復(fù)種植失敗患者外周血Th1/Th2細胞失衡起到再平衡的調(diào)節(jié)作用。

據(jù)報道，多種免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制藥物，比如免疫球蛋白(IVIG)、依那西普(Enbrel)、 阿達木單抗(HumiraTM)和他克莫司，可以有效改善RIF患者外周血Th1/Th2比例失衡，外周血Th1/Th2細胞比例升高的RIF患者使用上述藥物后可以顯著改善其臨床妊娠結(jié)局，提示外周血Th1/Th2細胞比例的調(diào)整對于成功的種植和妊娠維持非常重要[3， 23-24]。外周血TNFα/IL-10比例升高的RIF患者應(yīng)用免疫抑制劑羥氯喹可以顯著降低外周血TNF-α水平、升高IL-10水平，改善RIF患者的免疫狀態(tài)[25]。

本研究顯示地塞米松可以降低RIF患者外周血Th1/Th2細胞比例，并能改善RIF患者臨床結(jié)局，與文獻報道相一致。因此，地塞米松或許可以作為RIF患者免疫治療的一個候選藥物。無法否認的是本研究是一項初步研究，存在某些不足，在后期工作中我們將進一步擴大樣本量，通過隨機對照試驗進一步論證。