不同妊娠方式及女性年齡對流產(chǎn)組織染色體非整倍性的影響

王珺，陳書強(qiáng)，趙男，張亨德，李懋，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

近年來，隨著人類輔助生殖技術(shù)(ART)的廣泛應(yīng)用，其子代安全性問題日益引起人們的重視[1-2]。而ART后自然流產(chǎn)胚胎可能在一定程度上反映ART對胚胎遺傳物質(zhì)的影響。因此，研究ART后自然流產(chǎn)胚胎染色體情況，對從遺傳學(xué)角度探討ART的安全性有重要指導(dǎo)意義。本研究擬通過比較自然妊娠和ART妊娠發(fā)生早期自然流產(chǎn)的孕婦年齡、胚胎染色體異常率及其分布情況，探討不同妊娠方式及年齡與胚胎染色體異常的關(guān)系，從而為ART在遺傳學(xué)上的安全性問題提供咨詢依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014 ～2018年期間，我中心單胎早期自然流產(chǎn)或胚胎停育后行絨毛染色體非整倍性篩查的患者890例，將自然妊娠后流產(chǎn)的494例患者設(shè)為自然妊娠流產(chǎn)組，ART助孕妊娠后流產(chǎn)的396例患者設(shè)為輔助生殖妊娠流產(chǎn)組。另外將兩組患者以35歲為年齡分割界限，又分為<35歲組和≥35歲組。

二、研究方法

早期自然流產(chǎn)患者無菌清宮手術(shù)過程中，取絨毛組織15～20 mg，生理鹽水清洗絨毛組織至無血液殘留，剔除蛻膜，將絨毛組織剪碎，采用QIAGEN QIAamp DNA mini Kit(Cat.No.51304凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司，德國)進(jìn)行絨毛全基因組DNA提取，IonProton二代測序技術(shù)(Life Technologies)行檢測染色體非整倍性檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、流產(chǎn)患者基本信息及流產(chǎn)組織染色體情況

自然妊娠組患者平均年齡及流產(chǎn)孕周顯著小于輔助生殖妊娠流產(chǎn)組(P<0.01)。兩組之間染色體非整倍性發(fā)生率及性染色體組成情況均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同妊娠方式早期流產(chǎn)患者基本信息及流產(chǎn)組織染色體情況[(-±s)， %]

注：與自然妊娠流產(chǎn)組相比，*P<0.01

二、流產(chǎn)組織染色體異常分布

流產(chǎn)組織中，染色體異常樣本共計(jì)501例，1～22號，X，Y單一染色體異常382例，三倍體異常15例，≥2條染色體異常46例，染色體微缺失/重復(fù)58例。染色體出現(xiàn)單一異常的發(fā)生率最高，達(dá)76.25%。單一發(fā)生的染色體異常中，16號染色體異常102例，占26.70%，22號染色體異常及X染色體異常均有54例，發(fā)生率均為14.14%。所有流產(chǎn)組織中，無論何種妊娠方式，均無1號染色體及5號染色體異常記錄(圖1)。

圖1 流產(chǎn)組織染色體異常分布

三、不同妊娠方式流產(chǎn)組織染色體異常發(fā)生率分析

對于同一類染色體異常，不同妊娠方式流產(chǎn)組的發(fā)生率不同。輔助生殖妊娠流產(chǎn)組69，XXN占比(0.86%)顯著低于自然妊娠流產(chǎn)組(4.83%)(P<0.01)，而21號染色體異常占比(5.60%)顯著高于自然妊娠流產(chǎn)組(2.23%)(P<0.05)。除此以外的其它染色體異常在兩組占比無顯著差異(P>0.05)。自然妊娠流產(chǎn)組織中有6例為21三體，輔助生殖妊娠流產(chǎn)組織中有9例為21三體，兩者相比無顯著差異(P>0.05)。兩組患者平均年齡亦無顯著差異(P>0.05)。輔助生殖妊娠流產(chǎn)組織中存在4例21單體，而自然妊娠流產(chǎn)組織中無該異常(圖2，表2)。

四、不同妊娠方式及年齡分組對流產(chǎn)組織染色體異常的影響

輔助生殖妊娠流產(chǎn)組≥35歲流產(chǎn)患者占比顯著大于自然妊娠流產(chǎn)組(P<0.001)。不同妊娠方式組內(nèi)，<35歲患者染色體非整倍性發(fā)生率顯著低于≥35歲患者(P<0.01)。

染色體非整倍性高發(fā)類型中：16號染色體異常發(fā)生率在<35歲患者中顯著高于≥35歲患者(P<0.01)，而不同妊娠方式間無顯著差異(P>0.05)；22號染色體異常發(fā)生率在≥35歲人群中顯著高于<35歲人群(P<0.01)，而不同妊娠方式間無顯著差異(P>0.05)；≥35歲患者≥2條染色體異常發(fā)生率顯著高于<35歲患者(P<0.001)，且輔助生殖妊娠流產(chǎn)組顯著高于自然妊娠流產(chǎn)組(P<0.01)(表3)。

與自然妊娠流產(chǎn)組相比，*P<0.05，**P<0.01

組 別例數(shù)21號染色體異常(三體+單體)21三體21單體總例數(shù)患者平均年齡例數(shù)患者平均年齡例數(shù)患者平均年齡自然妊娠流產(chǎn)組2696(2.23)32.17±4.546(2.23)32.17±4.540—輔助生殖流產(chǎn)組23213(5.60)?32.62±4.639(3.88)32.00±5.104(1.72)34.00±3.56

注：與自然妊娠流產(chǎn)組比較，*P<0.05

表3 流產(chǎn)組織染色體異常與不同妊娠方式及年齡的關(guān)系[(-±s)， n(%)]

注：與輔助生殖流產(chǎn)組比較，aP<0.001；與同組≥35歲患者相比較，bP<0.01，cP<0.001

討 論

促排卵和配子及胚胎的體外操作是ART的主要組成部分。理論上，長時(shí)間和超生理劑量的外源性促性腺激素的使用可能會(huì)增加卵母細(xì)胞在第一次減數(shù)分裂時(shí)對環(huán)境的敏感性，使微管的機(jī)能失調(diào)，并且可能使質(zhì)量低下、本應(yīng)該閉鎖的那部分卵母細(xì)胞因?yàn)槁殉泊碳ぴ竭^主導(dǎo)卵泡的自然選擇過程而被募集[3]。這些均可能會(huì)引起DNA的復(fù)制錯(cuò)誤、DNA不穩(wěn)定、減數(shù)分裂過程異常及姐妹染色單體交換頻率增加[4]。而實(shí)際上Meta分析的結(jié)果表明ART技術(shù)不會(huì)增加染色體非整倍性的發(fā)生[5]。本研究結(jié)果顯示，494例自然妊娠流產(chǎn)患者與396例輔助生殖妊娠流產(chǎn)患者的染色體異常發(fā)生率及性染色體組成情況并無顯著差異(P均>0.05)，這與Meta分析結(jié)果一致。

兩組患者中，輔助生殖流產(chǎn)患者平均年齡以及流產(chǎn)孕周大于自然妊娠流產(chǎn)患者，這與ART患者人群的特殊性相關(guān)?？赡茉颍?1)此類患者一般都經(jīng)歷了自然妊娠失敗，反復(fù)早期流產(chǎn)或不良孕產(chǎn)史，在不斷嘗試而未獲得健康嬰兒出生的情況下，再來尋求輔助生殖技術(shù)助孕，勢必平均年齡偏大；(2)患者通過ART助孕成功后，臨床上通常會(huì)采用孕激素及雌激素類藥物對珍貴兒進(jìn)行保胎，使得不可避免的流產(chǎn)的發(fā)生有所滯后，因此造成流產(chǎn)的平均孕周偏大。

所有研究對象中非整倍性流產(chǎn)組織共計(jì)501例，從染色體異常類型上來看，單一染色體異常占比最高，達(dá)76.25%。其中，16號染色體異常發(fā)生率最高(26.70%)，其后依次是22號、X、15號、13號、21號染色體異常，這與文獻(xiàn)結(jié)論一致[6-7]。

比較不同妊娠方式流產(chǎn)組織染色體異常占比，輔助生殖妊娠流產(chǎn)組69，XXN占比顯著低于自然妊娠流產(chǎn)組(0.86% vs.4.83%，P<0.01)。69，XXN胚胎的可能形成機(jī)制有如下幾點(diǎn)：(1)2條精子進(jìn)入卵母細(xì)胞；(2)二倍體的精子進(jìn)入卵母細(xì)胞或者1個(gè)正常的精子進(jìn)入二倍體的卵母細(xì)胞；(3)卵母細(xì)胞內(nèi)第2極體滯留以致形成2個(gè)雌原核和1個(gè)雄原核；(4)原核碎裂[8]。其中最常見的原因是2條精子進(jìn)入卵母細(xì)胞，即3PN胚胎。輔助生殖技術(shù)可以識(shí)別3PN胚胎并不予移植，這排除了大部分69，XXN胚胎臨床妊娠的機(jī)會(huì)，而對于其他可能的形成因素，輔助生殖技術(shù)并不能很好的避免。因此，本研究中輔助生殖妊娠流產(chǎn)組織中仍有2例69，XXN核型。相比輔助生殖妊娠，自然妊娠狀態(tài)下機(jī)體并不能識(shí)別原核期3PN胚胎，而3PN往往不影響胚胎的早期發(fā)育，這可能是自然妊娠流產(chǎn)組織中69，XXN胚胎稍微多見的原因。

此外，輔助生殖妊娠流產(chǎn)組21號染色體異常占比高于自然妊娠組(5.60% vs.2.23%，P<0.05)。21號染色體異常中包含21三體異常與21單體異常。輔助生殖妊娠流產(chǎn)組21三體占比雖然高于自然妊娠流產(chǎn)組，但并無顯著差異(P>0.05)。值得關(guān)注的是，21單體是輔助生殖妊娠流產(chǎn)組中的特有現(xiàn)象。文獻(xiàn)顯示，有25%～30%的人類未受精卵為非整倍性，這類卵母細(xì)胞在自然妊娠或IVF助孕中不能受精，而ICSI技術(shù)的出現(xiàn)可能會(huì)促進(jìn)異常卵母細(xì)胞的受精[9]。這可能是因?yàn)?，在自然妊娠?1號染色體缺失的卵母細(xì)胞與染色體正常精子相結(jié)合，或者染色體正常的卵母細(xì)胞與21號染色體缺失的精子相結(jié)合，均會(huì)出現(xiàn)受精障礙，不能形成臨床妊娠，因此自然妊娠流產(chǎn)組的流產(chǎn)組織檢測結(jié)果中無21單體異常。而同樣的精子或卵母細(xì)胞異常情況，ICSI技術(shù)能夠幫助精卵突破受精障礙，使得21單體的胚胎繼續(xù)發(fā)育，甚至實(shí)現(xiàn)臨床妊娠，但最終難逃流產(chǎn)的命運(yùn)，因此在輔助生殖妊娠流產(chǎn)組的流產(chǎn)組織中可見21單體異常。本研究結(jié)果顯示，4例21單體流產(chǎn)的輔助生殖妊娠患者，均是通過ICSI技術(shù)助孕成功妊娠的，這在一定程度上驗(yàn)證了這一可能原因。

女性年齡與卵母細(xì)胞質(zhì)量有密切關(guān)系。女性在35歲之后受孕率開始下降，流產(chǎn)率開始上升。主要原因是35歲以后卵母細(xì)胞染色體非整倍性概率明顯增加[10]。因此，35歲成為高齡孕婦的界定標(biāo)準(zhǔn)[7]。本研究中，將不同妊娠方式流產(chǎn)患者以35歲為界，細(xì)分為<35歲和≥35歲兩個(gè)亞組。結(jié)果顯示，四組之間染色體非整倍性發(fā)生率的顯著差異來源于患者年齡，與妊娠方式無關(guān)。意味著患者年齡越大，染色體非整倍性發(fā)生率越高。單獨(dú)分析染色體異常的高發(fā)類型，22號染色體異常、≥2條染色體異常在高齡患者流產(chǎn)中高發(fā)。Pylyp等[11]發(fā)現(xiàn)<25歲時(shí)流產(chǎn)絨毛染色體異常占比為46.4%，而>40歲時(shí)流產(chǎn)絨毛染色體異常占比增長為63.2%。Dai等[12]發(fā)現(xiàn)女性年齡≥40歲時(shí)，胎兒染色體異常占比達(dá)60.61%，且伴隨3次自然流產(chǎn)史的高齡女性，其胎兒染色體異常數(shù)目也會(huì)增加。母親年齡是迄今唯一被證實(shí)的與生殖細(xì)胞非整倍體發(fā)生密切相關(guān)的因素。大于35 歲女性卵母細(xì)胞的染色體非整倍體率明顯上升，這可能與高齡女性卵母細(xì)胞減數(shù)分裂重組錯(cuò)誤、紡錘體聚合檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白缺陷和cohesion 蛋白減少等有關(guān)[13-14]。但并不是所有染色體異常都與女性年齡相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，15號染色體和Turner綜合征與女性年齡并不相關(guān)，而16號染色體異常更好發(fā)于低齡流產(chǎn)患者。形成這些差異的遺傳基礎(chǔ)尚不明確，有可能與父方年齡相關(guān)，也有可能與外界環(huán)境影響相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究分析。

總的來說，通過本中心輔助生殖妊娠流產(chǎn)患者與自然妊娠流產(chǎn)患者的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)輔助生殖妊娠組流產(chǎn)組織染色體的非整倍性并未增加，說明我中心并沒有因?yàn)榇倥怕巡划?dāng)增加胚胎染色體非整倍性的發(fā)生率。但是兩種妊娠方式在個(gè)別染色體異常占比以及染色體異常類型中表現(xiàn)出了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們認(rèn)為21號染色體異常在輔助生殖妊娠流產(chǎn)組中占比增加，可能與ICSI技術(shù)操作導(dǎo)致21單體增加相關(guān)；22號染色體異常及≥2條染色體異常在輔助生殖妊娠流產(chǎn)組中高發(fā)，可能與輔助生殖人群年齡偏大相關(guān)，且輔助生殖人群合并有各種不孕因素，這也可能是流產(chǎn)發(fā)生的誘因[16]，我們將在以后的研究中進(jìn)一步分析討論。